JIS L 1902:2015 繊維製品の抗菌性試験方法及び抗菌効果 | ページ 2

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L 1902 : 2015
5.23 ピンセット 滅菌できる材料で作られたもの。
5.24 ステンレス分銅 質量が200 g±10 gで,直径が35 mm±1 mmのもの。
5.25 金網かご 高圧蒸気滅菌機(オートクレーブ)で,試験片などを滅菌するのに使用できるもの。
5.26 アルミニウムホイル 金網かごなどを包めるもの。
5.27 振とう培養機 温度37 ℃±2 ℃,110回/分,振り幅30 mm程度に設定できるもの。
5.28 オートクレーブ 温度120 ℃±2 ℃,圧力103 kPa±5 kPaで滅菌できるもの。

6 試薬及び培地

6.1   水 微生物学用培地の作製に使用できる分析用品質のもので,新規に蒸留され,イオン交換したも
ので,限外ろ過したもの及び/又は逆浸透膜でろ過した,あらゆる毒性物質及び細菌成長阻害物質を含ん
でいないもの。
6.2   トリプトンソーヤ培地(TSB) 次の成分をよくかくはんし,pHを7.2±0.2に調整した後,オート
クレーブ(5.28)によって滅菌したもの。
− カゼイン製トリプトン                                           17 g
− 大豆製ペプトン                                                  3g
− 塩化ナトリウム(NaCl) JIS K 8150による。                       5g
− グルコース                                                      2.5 g
− りん酸水素二カリウム                                            2.5 g
− 水(6.1)                                                    1000 mL
6.3   トリプトンソーヤ寒天培地(TSA) 次の成分をよくかくはんし,pHを7.2±0.2に調整した後,オ
ートクレーブによって滅菌したもの。
− カゼイン製トリプトン                                           15 g
− 大豆製ペプトン                                                  5g
− 塩化ナトリウム(NaCl)                                          5g
− 寒天                                                           15 g
−水                                                            1000 mL
6.4   トランスファー法用寒天培地 次の成分をよくかくはんし,pHを7.2±0.2に調整した後,オートク
レーブによって滅菌したもの。
− カゼイン製トリプトン                                            0.75 g
− 大豆製ペプトン                                                  0.25 g
− 塩化ナトリウム(NaCl)                                          5g
− 寒天                                                           15 g
−水                                                            1000 mL
6.5   ニュートリエント培地(NB) 次の成分をよくかくはんし,pHを6.9±0.2に調整した後,オートク
レーブによって滅菌したもの。
− 肉エキス                                                        3g
− ペプトン                                                        5g
−水                                                            1000 mL
6.6   ペプトン食塩水 次の成分をよくかくはんし,pHを6.9±0.2に調整した後,オートクレーブによっ
て滅菌したもの。

――――― [JIS L 1902 pdf 6] ―――――

                                                                                              5
                                                                                   L 1902 : 2015
− カゼイン製ペプトン                                              1g
− 塩化ナトリウム(NaCl)                                          8.5 g
−水                                                            1000 mL
6.7   生理食塩水 次の成分をよくかくはんし,その後,オートクレーブによって滅菌したもの。
− 塩化ナトリウム(NaCl)                                          8.5 g
−水                                                            1000 mL
6.8   SCDLP培地 次の成分をよくかくはんし,pHを7.2±0.2に調整した後,オートクレーブによって
滅菌したもの。
− カゼイン製ペプトン                                             17 g
− 大豆製ペプトン                                                  3g
− 塩化ナトリウム(NaCl)                                          5g
− りん酸水素二カリウム                                            2.5 g
− グルコース                                                      2.5 g
− レシチン                                                        1g
− ポリソルベート80                                                7g
−水                                                            1000 mL
6.9   菌液調製用緩衝液 0.037 %のスクロースを含む,0.005 mol/Lのりん酸二水素ナトリウムからなり,
pHを7.2±0.2に調整したもの。
6.10 不活性化液 標準的な不活性化液の組成は,次による。
− ポリソルベート80                                               30 g
− 卵黄レシチン                                                    3g
− ヒスチジン塩酸塩                                                1g
− 肉又はカゼイン製ペプトン                                        1g
− 塩化ナトリウム(NaCl)                                          4.3 g
− りん酸二水素カリウム                                            3.6 g
− りん酸二ナトリウム二水和物                                      7.2 g
−水                                                            1000 mL
6.11 混釈平板培養法用寒天培地(EA) 次の成分をよくかくはんし,pHを7.2±0.2に調整した後,オー
トクレーブによって滅菌したもの。
− 脱水酵母エキス                                                  2.5 g
− カゼイン製トリプトン                                            5.0 g
− グルコース                                                      1.0 g
− 寒天                                                           12 g15 g 1)
−水                                                            1000 mL
    注1) 必要質量は,製品のゲル強度による。
6.12 菌転写法用寒天培地 次の成分をよくかくはんし,オートクレーブによって滅菌したもの。
− 寒天                                                           20 g
−水                                                            1000 mL
6.13 細菌の凍結防止溶液 150 g/Lのグリセリン又は100 g/Lのジメチルスルホキシドを含む凍結防止溶
液で,次の手順で作製したもの。

――――― [JIS L 1902 pdf 7] ―――――

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L 1902 : 2015
a) トリプトンソーヤ培地(TSB)(6.2)又はニュートリエント培地(NB)(6.5) : 1 000 mLを加える。グ
    リセリン150 g又はジメチルスルホキシド100 gをよくかくはんし,オートクレーブで滅菌する。
b) グリセリンを含む溶液については,オートクレーブでその混合液を滅菌する。ジメチルスルホキシド
    を含む溶液については,0.22 mのメンブランフィルタを使用し,混合液を滅菌する。
    注記 凍結防止溶液は,グリセリン又はジメチルスルホキシドを含有している保存用のものであり,
          規定された溶液と同様に菌株の保存ができるものであれば,市場で購入できる製品の使用を推
          奨する。
6.14 ATP標準試薬原液 アデノシン-5'三りん酸二ナトリウム三水和物60.5 mgを水に溶かし,1 000 mL
に調製したもの。その濃度は1×10−4 mol/Lである。
  調製後,調製溶液はしっかり密封された容器に入れ,−20 ℃又はそれ以下の温度で冷凍保存する。調製
溶液は,調製後6か月以内に使用しなければならない。
  なお,一度解凍したものを再凍結してはならない。
    注記 アデノシン-5'三りん酸二ナトリウム三水和物の混合量は,購入した製品のATP含有量から計算
          される。
6.15 ATP発光試薬用緩衝液 次の成分からなり,pHを7.2±0.2に調整したもの。
− N-(トリスヒドロキシメチル)メチルグリシン                     1117 mg
− エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物                    183 mg
− 酢酸マグネシウム四水和物                                      808 mg
− DL-ジチオスレイトール                                           6.7 mg
− デキストリン                                                25000 mg
− スクロース                                                    925 mg
−水                                                             250 mL
6.16 ATP発光試薬 次の成分からなり,完全に溶解させた後,使用前に15分間室温で静置させたもの。
  なお,調製後3時間以内に使用する。また,通常と異なるATP発光試薬を使用するときは,その組成を
記録しなければならない。
− ルシフェラーゼ(EC : 1.13.12.7)                                16.0 mg
− D-ルシフェリン                                                 12.6 mg
− うし血清アルブミン                                             56 mg
− ATP発光試薬用緩衝液(6.15)                                    30 mL
6.17 ATP抽出試薬 次の成分からなり,pHを7.2±0.2に調整したもの。
  なお,通常と異なるATP抽出試薬を使用するときは,その組成を記録しなければならない。
− N-(トリスヒドロキシメチル)メチルグリシン                       45 mg
− 10 %塩化ベンザルコニウム水溶液                                  0.2 mL
−水                                                               9.8 mL
6.18 ATP消去試薬 次の成分からなり,pHを6.0±0.5に調整したもので,トリプトンソーヤ培地(TSB)
(6.2),又はニュートリエント培地(NB)(6.5)中のATP量を15分以内に10−13 mol/L未満に減少させた
もの。
− アピラーゼ(EC : 3.6.1.5)                                      46国際単位/mL
− アデノシンりん酸デアミナーゼ(EC : 3.5.4.6又はEC : 3.5.4.17)    46国際単位/mL
− スクロース                                                     37 mg

――――― [JIS L 1902 pdf 8] ―――――

                                                                                              7
                                                                                   L 1902 : 2015
− うし血清アルブミン                                             20 mg
− 0.05 mol/L 2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物緩衝液          10 mL
  この試薬は,調製後8時間以内に使用しなければならない。
  なお,通常と異なる消去試薬を使用するときは,その組成を記録しなければならない。
6.19 ATP標準試薬調製のためのSCDLP培地又は他の培地 次の成分からなり,洗い出し液のATP濃度
が不活性化剤の添加によって10−11 mol/Lを超過した場合に作製する。
− SCDLP培地(6.8)又は他の培地                                   10 mL
− ATP消去試薬(6.18)                                             1 mL
  調製後,微生物汚染がないように注意して,30 ℃37 ℃で1時間保持する。次に,70 ℃90 ℃のウ
ォーターバス(5.3)に1時間保持し,その後室温まで冷却する。続いて,調製溶液を冷蔵庫に保存し,24
時間以内に使用する。
6.20 洗い出し用生理食塩水 次の成分からなり,よくかくはんして,オートクレーブ(5.28)で滅菌した
もの。
− 塩化ナトリウム(NaCl)                                          8.5 g
− ポリソルベート80                                                2.0 g
−水                                                            1000 mL
    注記1 試験に使用する試薬は,分析用品質及び/又は微生物試験用のものがよい。
    注記2 培地作製には,市場で利用可能な乾燥製品を使用することが推奨される。これらの培地作製
            に当たっては,製造業者の作製指示書に従う。

7 試験菌株

7.1 菌株

  附属書Aに規定する細菌から,いずれかを選択して試験に用いる。

7.2 菌株の保存

7.2.1  一般事項
  菌株の保存は,供給者の推奨方法に従わなければならない。
7.2.2  セラミックビーズ法
  セラミックビーズ法は,次による。
a) 推奨された培地とともに凍結保存された細菌株のサンプルを用意し,トリプトンソーヤ培地(TSB)
    (6.2)5 mLに再懸濁する。その懸濁液のサンプルを用意し,それをトリプトンソーヤ寒天培地(TSA)
    (6.3)の入ったシャーレ(5.17)に分離し載せる。
b) その細菌株を18時間24時間,37 ℃±2 ℃の条件で培養する。培養後,株の純度の検証にはシャー
    レに分離した培養株を使用する。検証後,保存原液を用意する。
c) 0.7 mLの培養原液のサンプルを取り,シャーレのトリプトンソーヤ寒天培地(TSA)の表面に塗り広
    げる。b) に規定した条件下で,寒天表面上の培養原液を18時間24時間培養する。
d)   SA寒天の平板培養表面上に10 mLの細菌の凍結防止溶液(6.13)を加える。次に,滅菌したガラス
    棒スプレッダーを使い,寒天上に細菌を再懸濁する。寒天上から懸濁された細菌をサンプル採取し,
    それを100 mLの凍結防止溶液で希釈し,それを20 ℃で30分間培養する。
e) ピペット(5.15)を使用し,1 mLの懸濁液をサンプル採取し,そのサンプルを突沸防止粒子(ガラス
    ビーズ)(5.19)を入れたバイアル瓶(5.16)に移す。ビーズの周りに細菌懸濁液を付着させるために,

――――― [JIS L 1902 pdf 9] ―――――

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L 1902 : 2015
    バイアル瓶を振とうする。このとき,ジメチルスルホキシドを含む凍結防止溶液を使用している場合
    は,それを室温環境に1分以上放置してはならない。また,グリセリンを含む凍結防止溶液を使用し
    ている場合は,それを20 ℃で30分間保持する。
f)  滅菌したピペットで余分な凍結防止溶液を除去する。バイアル瓶を−70 ℃,又はそれ以下の冷凍庫
    (5.12)に保存する。
g) 次に,生菌数の確認のため,附属書Cに規定する混釈平板培養法を実施する。初めに,連続希釈法に
    よって,10−610−7の希釈懸濁液を用意する。それぞれの希釈液から1.0 mLのサンプルを採取し,そ
    れをシャーレに分けて移す。45 ℃±1 ℃まで冷却した12 mL15 mLのEA寒天培地溶液を加える。
    それを37 ℃±2 ℃の条件で18時間24時間培養する。
h) 平板培養した菌のコロニー数を数え,その懸濁液が5×108 CFU/mL以下であることを確認する。
7.2.3  グリセリン懸濁法
  グリセリン懸濁法は,次による。
a) 5 mLの適切な培地を含む15 mLの試験管に新規に増殖され,分離したコロニーを含む培養液を接種
    する。37 ℃で,通常5時間から一晩,細菌培養の増殖曲線が対数後期又は定常期に到達するまで培養
    する。
b) 保存場所において−70 ℃以下で保存されているそれぞれの細菌株について,滅菌し,ラベルが貼られ
    た極冷温用バイアル瓶を用意し,その極低温用バイアル瓶に225 μLの滅菌した80 %グリセリンを入
    れる。
c) 1.0 mLの細菌培養液(15 %グリセリンを含む冷凍保存品)を加える。ミキサ(5.4)でよくかくはんし,
    試験管に入れ,−70 ℃以下で保存する。
d) 液体グリセリン作業原液として−20 ℃で保存されているそれぞれの細菌株について,80 %グリセリ
    ン及び細菌培養液をラベルが貼られたポリプロピレン試験管中に等量をピペットに入れ,細菌の生存
    力を低下させる氷結を避けるため,内容物をよくかくはんする。その後,試験管を−20 ℃設定の冷凍
    庫で保存する。可能な場合には,1週間後に細菌の生存力を確認する。
e) −70 ℃以下で保存されたグリセリン保存の細菌株の回収のため,滅菌した爪よう(楊)枝を使用し,
    固形物片を取り出す。その後,細菌を適切な培地に筋状に塗り付ける。冷凍保存物を解凍してはなら
    ない。それは,冷凍・解凍の繰り返しを行うと1回のサイクルで細菌の生存力を50 %消失する結果と
    なる。
f)  5 mLの一晩培養液に対し,−20 ℃の作業原液を50 μL100 μL接種する。
7.2.4  斜面培地法
  斜面培地法は,次による。
a) 斜面培地の作製は,試験管にあらかじめ温めて溶解した混釈平板培養法用寒天培地(EA)(6.11)を
    約10 mL注ぎ,綿栓をして高圧蒸気滅菌し,滅菌終了後,清浄な室内に試験管を水平面に対して約15
    度傾けて置き,内容物を凝固させる。凝結水がなくなったものは溶解し,再び凝固させて使用する。
b) 細菌の移植は,次の手順によって無菌的に行う。片手に元株及び移植しようとする斜面培地を持ち,
    他方の手に白金耳の柄を持ち,その手で綿栓を抜き取り,試験管の口を火炎滅菌する。
c) 次に,白金耳を火炎滅菌し,斜面培地の凝結水のある部分に白金耳のループを差し込んでよく冷却し
    てから,元株の試験管に入れる(図1参照)。細菌の繁殖面から白金耳でかき取り,斜面培地に塗抹し,
    再び試験管の口を火炎滅菌し,元のように綿栓をする。使用後の白金耳は火炎滅菌する。
d) 細菌を移植した斜面培地は,37 ℃±2 ℃で24時間48時間培養し,その後は温度5 ℃10 ℃で保

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