JIS K 3706-1:2008 培地の試験方法―リステリア・モノサイトゲネス用培地―第１部：リステリア・モノサイトゲネスの検出 | ページ 2

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K 3706-1 : 2008
             る。
    JIS K 3702 培地の試験方法−試料懸濁液及び希釈系列の調製方法
      備考 ISO 6887-1:1999,Microbiology of food and animal feeding stuffs−Preparation of test samples,
             initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination−Part 1: General rules for
             the preparation of the initial suspension and decimal dilutionsからの引用事項は,この規格の該当
             事項と同等である。
    JIS K 8008 生化学試薬通則

3. 定義

 この規格で用いる主な用語の定義は,JIS K 3701,JIS K 3702及びJIS K 8008によるほか,次
による。
3.1   リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes) この規格で規定する試験で,選択分離培
地上に定形コロニーを形成し,特徴的な形態,生理及び生化学的性質を示す微生物。
3.2   リステリア・モノサイトゲネスの検出(detection of Listeria monocytogenes) この規格で規定する試
験で,所定の質量又は体積の試料中におけるリステリア・モノサイトゲネスの有無を判定すること。
3.3   精製水 JIS K 8008の3.2に規定するA2の水。
    備考 これを超える精製度のものを使用することに関しては制限しない。滅菌水は,イオン交換水の
          品質以上のものを乾熱滅菌若しくは蒸気滅菌又はフィルターでろ過し除菌したものとする。ま
          た,市販の精製水を用いる場合は,この規格で規定する精製水と同等以上の品質のものとする。

4. 一般原則

 リステリア・モノサイトゲネスの検出には,連続する4段階の操作を必要とする。附属書
A参照。
    備考 リステリア・モノサイトゲネスは,菌数が少ない可能性がある上に,他の属の微生物が同時に
          多数存在することがよくあるため,選択増菌を行う必要がある。また,損傷したリステリア・
          モノサイトゲネスを検出することも必要であり,これは低濃度の阻害剤を含有する一次選択増
          菌培地を用いることによって,部分的ではあるが可能である。

4.1 half Fraserブロスを用いた一次選択増菌

 塩化リチウム,アクリフラビン及びナリジクス酸を含有
する一次増菌用選択培地(half Fraserブロス)に接種する。half Fraserブロス(附属書Bに示す塩化リチウ
ム溶液の半量のアクリフラビン溶液及びナリジクス酸溶液を含有する。)は,試料の希釈用としても使用で
きる(9.1)。培養は,30 ℃で24時間行う。

4.2 Fraserブロスを用いた二次選択増菌

 二次選択増菌用Fraserブロスに,4.1で得られた培養液を接種
する。培養は,37 ℃で48時間行う。

4.3 平板培養及び同定

 4.1及び4.2で得られた培養液を,次の選択分離培地上に塗抹する。
a) 第一選択分離培地 Ottaviani & Agostiリステリア寒天培地(Agar L. according to Ottaviani and Agosti;
    ALOA)
    備考 ALOAは,市販されているものの一例である。同じ組成・配合の他の培地を使用しても差し支
          えない。
b) 第二選択分離培地 各検査施設が選定した,Ottaviani & Agostiリステリア寒天培地と異なった組成の
    選択分離培地。
  Ottaviani & Agostiリステリア寒天培地は37±1 ℃で培養し,24±3時間後(必要に応じて,更に24±3
時間後)に検査を行って,リステリア・モノサイトゲネスと推定される特徴的なコロニーの有無を調べる。

――――― [JIS K 3706-1 pdf 6] ―――――

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第二の選択培地については適切な温度で培養し,適切な時間が経過した後に検査を行う。
    備考 ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼC(PIPLC)の活性の弱いリステリア・モノサイ
          トゲネスもある。この種の菌株は,総培養時間が4日間を超えることもある。病原性をもつ可
          能性がある菌株も一部存在する。

4.4 確認試験

 平板培養(4.3)したリステリア・モノサイトゲネスと推定されるコロニーとの継代培養
を行い,適切な形態学的・生理学的・生化学的試験によって確認する。

5. 培地及び試薬

5.1 一般事項

 JIS K 3701による。
    備考 培地及び試薬の組成並びに調製法を,附属書Bに示す。

5.2 一次選択増菌培地 : half Fraserブロス

 附属書B.1による。

5.3 最大濃度の選択剤を含有する二次選択増菌培地 : Fraserブロス

 附属書B.2による。

5.4 選択分離培地

5.4.1  第一選択分離培地 : Ottaviani & Agostiリステリア寒天培地(Agar L. according to Ottaviani and Agosti,
ALOA) 附属書B.3による。
    備考 ALOAは,市販されているものの一例である。同じ組成・配合の他の培地を使用できる。
5.4.2  第二選択分離培地 市販の培地を使用する場合は,その調製に関して,製造業者の取扱説明書に厳
密に従う。

5.5 固形培地 : トリプトソイ酵母エキス寒天培地

5.6 液体培地 : トリプトソイ酵母エキスブロス

5.7 ヒツジ血液寒天培地

 附属書B.7による。

5.8 炭水化物利用試験(糖発酵試験)用ブロス(ラムノース及びキシロース)

 附属書B.8による。

5.9 運動性試験用半流動寒天培地(任意)

 附属書B.9による。

5.10 CAMP(Christie,Atkins,Munch-Petersen)試験用培地及び試験菌株

 附属書B.10による。

5.11 過酸化水素水

 附属書B.11による。

5.12 りん酸緩衝生理食塩水(PBS)

 附属書B.12による。

6. 装置及びガラス器具

 通常の微生物検査用機器(JIS K 3701)及び次による。

6.1 乾熱滅菌器又は蒸気滅菌器

 JIS K 3701による。

6.2 乾燥キャビネット又は細菌培養器

 25±1 ℃50±1 ℃を保持できるもの。

6.3 細菌培養器

 接種した培地,平板及び試験管を,次の温度に維持できるもの。
a) 25±1 ℃
b) 30±1 ℃
c) 37±1 ℃

6.4 恒温水槽

 47±2 ℃に保持できるもの。

6.5 白金耳及び白金線

 白金・イリジウム合金又はニッケル・クロム合金製で直径約3 mmの白金耳及び
同素材の白金線,又はホッケー用スティック状(L字状)のガラス棒(コンラージ棒)若しくは白金耳。

6.6 pHメータ

 25 ℃における表示分解能が0.01 pHであり,±0.1 pHの精度で測定できるもの。

――――― [JIS K 3706-1 pdf 7] ―――――

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6.7 試験管又はフラスコ

 培地の滅菌・保存及び液体培地の培養に使用できるもの。

6.8 メスシリンダ

 希釈液及び完全培地の調製に使用できる501 000 mLの容量のもの。

6.9 吹出し式(先端目盛)メスピペット

 容量が10 mL及び1 mLで,それぞれ0.5 mL,0.1 mL単位で
目盛られているもの。

6.10 シャーレ

 直径が90100 mmのもの。

6.11 ジャー(任意)

 微好気培養に適したもの。

6.12 混合ガス(任意)

 微好気培養に使用する,規定の組成(CO2 512 %,O2 515 %及びN2 75 %)
のもの。

6.13 透過光線試験(斜光法)用の機器(任意)

 附属書Cによる。

6.14 顕微鏡

    備考 位相差顕微鏡が望ましい。スライドグラス及びカバーグラスも用意する。

7. サンプリング方法

 この規格では規定しない。個別の規格に当該試料のサンプリング方法の規定がな
い場合は,受渡当事者間の協定による。
    備考 検査対象を真に代表する試料が,輸送中又は保存中に,損傷又は変質することなく,検査室に
          届けられることが重要である。

8. 試料の調製

 当該試料を扱う個別の規格による。個別の規格がない場合は,受渡当事者間の協定によ
る。

9. 手順

9.1 試料及び試料懸濁液

 試料懸濁液の調製においては,希釈液として5.2に規定する一次選択増菌培地
を使用する。試料懸濁液は一般に,試料x g又はx mLを9x g又は9x mLの一次選択増菌培地(5.2)に加
えて,試料と一次選択増菌培地との比率が1/10(質量対体積又は体積対体積)となるように調製する(JIS
K 3702参照)。

9.2 一次選択増菌

 9.1に従って調製した試料懸濁液を,30 ℃で24±2時間培養する[6.3 b)]。
    備考 培養中に黒色を呈することがある。

9.3 二次選択増菌

9.3.1  試料懸濁液を24±2時間培養した後(一次選択増菌,9.2),9.2で得られたその培養液0.1 mLを色
調にかかわらず,10 mLの二次選択増菌培地(Fraserブロス,5.3)が入った試験管(6.7)に移す。
9.3.2  接種した培地(9.3.1)は,37 ℃で48±2時間培養する。

9.4 平板培養及び同定

9.4.1  一次増菌培養液(9.2)を白金線又はガラス棒(6.5)にとり,第一選択分離培地(Ottaviani & Agosti
リステリア寒天培地)(5.4.1)上に,単独コロニーが得られるように接種する。第二選択分離培地(5.4.2)
にも同様に接種する。
9.4.2  37 ℃で48±2時間培養した二次選択増菌培養液(9.3.2)について,2種の選択分離培地を用いて
9.4.1に規定する手順を繰り返す。
9.4.3  9.4.1及び9.4.2で作製した平板は,Ottaviani & Agostiリステリア寒天培地(5.4.1)の場合は37 ℃
に,第二選択分離培地(5.4.2)の場合は適切な温度に設定した細菌培養器内で倒置して培養する。第二選
択分離培地として市販の培地を使用する場合は,製造業者の取扱説明書に従う。

――――― [JIS K 3706-1 pdf 8] ―――――

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9.4.4  Ottaviani & Agostiリステリア寒天培地の場合は,24±3時間の培養及び24±3時間の追加培養(24
時間培養しても増殖の程度が弱く,コロニーが認められないとき。)する。第二選択分離培地は,取扱説明
書にのっとった時間だけ培養し,リステリア・モノサイトゲネスと推定されるコロニーの有無について各
平板(9.4.3)を調べる。
9.4.4.1  Ottaviani & Agostiリステリア寒天培地 周囲に不透明のハロー(halo)を伴った青緑色の定形的
コロニーは,リステリア属とみなす。24±3時間の培養後において,増殖がわずかであった場合若しくは
コロニーが全く認められなかった場合,又は定形的コロニーが存在しなかった場合には,更にその平板を
24±3時間培養する。
    備考1. 酸の刺激によって,ハローがごく弱い(場合によっては,ハローがない。)リステリア・モノ
            サイトゲネス株もある。
        2. PIPLC活性が緩慢で,培養時間が一定時間,例えば4日間を越えて検出されるリステリア・
            モノサイトゲネス株は,毒性を示すことがある(参考文献[2]参照)。
9.4.4.2  第二選択分離培地 適切な時間が経過した後,使用した培地の種類に応じて,その特徴からリス
テリア・モノサイトゲネス又はリステリア・モノサイトゲネスと推定されるコロニーの有無を調べる。

9.5 リステリア属の確認

9.5.1  確認試験用のコロニーの選択
9.5.1.1  確認試験のため,各選択培地(9.4.4.1及び9.4.4.2参照)の各平板から,リステリア属と推定され
るコロニーを5個釣菌する。1平板上の推定コロニーの数が5個未満である場合は,そのコロニーすべて
を確認試験用として釣菌する。
9.5.1.2  選択したコロニーを,あらかじめ乾燥させておいたトリプトソイ酵母エキス寒天培地(TSYEA,
5.5)上に,よく分離したコロニーが形成されるような方法で画線塗抹する。37 ℃に設定した細菌培養器
[6.3 c)]内に平板を置いて,1824時間又は十分に増殖するまで培養する。
  接種した培地の培養温度は,受渡当事者間で合意を得,試験報告書に記録する。
  直径12 mmで凸状を呈し,全縁をもつ無色不透明のコロニーを定形コロニーとする。コロニーがよく
分離していない場合は,リステリア・モノサイトゲネスの定形コロニーを新たなTSYEA平板に画線塗抹
する。TSYEAで純培養したコロニーについて,次の試験を実施する。
    備考 透過光線試験(附属書C参照)を実施してもよい。この試験においては,寒天培地を薄くする
          (1平板当たり15 mL)。
9.5.2  カタラーゼ反応 9.5.1.2で得られた独立コロニーをとり,スライドグラス上に1滴滴下した過酸化
水素水(5.11)に懸濁する。気泡がすぐに発生した場合は,陽性である。
9.5.3  グラム染色 9.5.1.2で分離されたコロニーに,グラム染色(JIS K 3701の10.6.2参照)を施す。
リステリア・モノサイトゲネスは,グラム陽性の細く短いかん(桿)菌として観察される。
9.5.4  運動性試験(必要な場合) 9.5.1.2で得られた分離コロニーをとり,TSYEB(5.6)の入った試験管
内で懸濁する。25 ℃に設定した細菌培養器[6.3 a)]内で824時間,培地に混濁が認められるまで培養
する。白金線(6.5)を用いて,上記の培養液を清浄な顕微鏡用スライドグラス上に1滴とり,カバーグラ
スをかけ,顕微鏡(6.14)で調べる。リステリア・モノサイトゲネスは,回転運動を示す,細く短いかん
(桿)菌として観察される。25 ℃を超えて培養すると,この運動を示さないことがあるため,常に既知の
培養菌と比較する。球菌,大きなかん(桿)菌又は泳ぐように早く動くかん(桿)菌は,リステリア・モ
ノサイトゲネスではない。
  この他の運動性試験として,接種用白金線(6.5)を用いてTSYEA上の定形コロニー(9.5.1.2)を釣菌

――――― [JIS K 3706-1 pdf 9] ―――――

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し,運動性試験用半流動寒天培地(5.9)にせん(穿)刺して,25 ℃に設定した細菌培養器[6.3 a)]にて
48時間培養する方法がある。せん(穿)刺部周辺の菌の発育を調べる。リステリア・モノサイトゲネスは
運動性をもち,定形な傘状の発育パターンを示す。発育が十分でない場合は,更に最長5日間培養してせ
ん(穿)刺部周辺を再度観察する。リステリア・モノサイトゲネスの検出に通常従事している微生物学専
門家が解析を行う場合,この検査は実施しなくともよい。

9.6 リステリア・モノサイトゲネスの確認

9.6.1  溶血試験
9.6.1.1  形態学的及び生理学的特性並びにカタラーゼ反応によって,リステリア・モノサイトゲネスであ
ることが確認できる場合には,ヒツジ血液寒天平板(附属書B.7)に接種し,溶血反応を確認する。使用
前に寒天培地の表面をよく乾燥させる。白金線(6.5)を用いて,9.5.1.2で分離されたコロニーを釣菌し,
1コロニー1点ずつ平板にせん(穿)刺培養する。そのとき,同時に陽性リステリア・モノサイトゲネス及
び陰性対照培養菌株リステリア・イノキュアのせん(穿)刺培養を行う。
  37 ℃で24±2時間培養後,試験菌株及び対照菌株を調べる。
  明るい光の下で各平板を調べ,試験菌株と対照菌株とを比較する。
  リステリア・モノサイトゲネスは,細く透明で明るい溶血帯を呈する(         血,図1)が,リステリア・
イノキュアではせん(穿)刺部周囲に透明な溶血帯が認められない。     血は,接種部周辺の寒天培地上
に発育したコロニーを取り除くと,より容易に観察される。L. seeligeriは弱い溶血を示す。リステリア・
イバノビは通常,幅広で境界の明りょうな       血帯を呈する。
9.6.1.2  溶血反応試験はヒツジ赤血球を用いて,次のように実施してもよい。
  150                         附属書B.6)中にコロニーを懸濁し,37 ℃で2時間培養する。次に,ヒツジ赤血球
(附属書B.4)150            えて37 ℃で1560分間培養した後,3±2 ℃で約2時間冷却し,溶血活性に
ついて調べる。溶血反応が明確でない場合は,3±2 ℃で最長24±3時間放置する。
9.6.2  炭水化物利用試験(糖発酵試験) 白金耳(6.5)を用いて炭水化物利用試験(糖発酵試験)用の
各ブロス(5.8)それぞれにTSYEBの培養液(9.5.4)を接種し,37 ℃で最長5日間培養する。黄色を呈し
た場合は陽性(酸産生)であり,反応は主にたいてい2448時間以内に生じる。
9.6.3  CAMP試験 あらかじめ培養した黄色ブドウ球菌(S. aureus)及びロドコッカス・エクイ(R. equi)
(附属書B.10.4)をそれぞれ,ヒツジ血液寒天培地(5.7)上に単線で画線塗抹する。このとき,双方の培
養菌株が平行に,かつ,反対側で向かい合う形とする(図1)。薄く平らに接種する必要があるが,接種用
白金耳又は白金線(6.5)を寒天培地に対して直角に保持して使用する。
  9.5.1.2で分離された試験菌株を,上記の培養菌株に対して直角となるように,同様の方法で画線塗抹す
る。試験菌株,黄色ブドウ球菌及びロドコッカス・エクイは,接触せず,最も近接する部分で12 mm離
す。数個の試験菌株を同一の平板上に画線塗抹してもよい。
  対照菌株であるリステリア・モノサイトゲネス,リステリア・イノキュア及びリステリア・イバノビを
同時に,画線塗抹する。ヒツジ血液寒天培地(5.7)を使用する場合は,平板を37 ℃で1824時間培養す
る。2層平板培地(附属書B.10.3)を使用する場合は,37 ℃で1218時間培養する。
  試験菌株と各培養菌株(黄色ブドウ球菌及びロドコッカス・エクイ)とが交差する点で      血帯の増大
が認められれば,陽性とする。
  リステリア・イバノビとロドコッカス・エクイとの陽性反応では,幅広(510 mm)で“矢じり形”の
溶血が認められる。試験菌株とロドコッカス・エクイの拡散域との交差点において,溶血の弱い小さな区
域が1 mmほど拡大するだけであれば,陰性とみなす。

――――― [JIS K 3706-1 pdf 10] ―――――

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