23
L 1922 : 2016
附属書C
(規定)
TCID50測定法
C.1 試験手順
C.1.1 10.3の96穴マイクロプレートに,単層培養した細胞が均一に分布していることを倒立顕微鏡(7.16)
で確認した後,増殖培地を除去する。
C.1.2 維持培地(9.8)0.1 mLを加え,細胞表面を洗浄した後,余分な維持培地を除去する。この操作を
2回繰り返し,細胞表面を洗浄する。
C.1.3 洗い出し液の各希釈系列0.1 mLを1希釈系列当たり8穴ずつ,細胞表面に接種する。すなわち,
最初の列の8穴に洗い出し原液を接種し,第2の列には1/10希釈のウイルス懸濁液を接種する。最後の列
には,細胞の検証のため維持培地(9.8)0.1 mLを接種する。
C.1.4 C.1.3の96穴マイクロプレートを表C.1の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,
1時間保温し,ウイルスを細胞に吸着させる。
C.1.5 プレートから上澄みを除去する。
C.1.6 維持培地(9.8)0.1 mLを加えて表面を洗浄後,余分な維持培地を除去する。
C.1.7 ネコカリシウイルスの場合は,維持培地(9.8)0.2 mLを加える。インフルエンザウイルスの場合
は,維持培地(9.16)0.2 mLを加える。その後,96穴マイクロプレートを表C.1の温度に設定したCO2イ
ンキュベーター(7.24)に入れ,7日間培養する。
C.1.8 倒立顕微鏡(7.16)によってそれぞれの穴の細胞変性効果を確認する。
C.1.9 細胞変性効果を確認後,ベーレンス・ケルバー(Behrens and Karber)法によってウイルスの感染価
を算出する。
表C.1−CO2インキュベーターの設定条件
試験対象ウイルス インフルエンザウイルス ネコカリシウイルス
規定箇条番号 10.4.4.2.2及び13.2
吸着温度設定(℃)
34 37
培養温度設定(℃)
――――― [JIS L 1922 pdf 26] ―――――
24
L 1922 : 2016
附属書D
(規定)
培地の組成
D.1 概要
培地は市場で入手可能であり,細胞培養に使用する。期待する細胞増殖が観察される場合は,他の培地
も使用できる。
D.2 EMEM培地の組成
EMEM培地の組成を,表D.1に示す。EMEM培地は,市販品を利用することができる。不足する成分が
ある場合は,表D.1によって追加する。
表D.1−EMEM培地の組成
水1 000 mL中の組成 CAS No. mg
L-アルギニン一塩酸塩(L-Arginine HCl) 1119-34-2 126.40
L-シスチン二塩酸塩(L-Cystine 2HCl) 30925-07-6 31.20
L-グルタミン(L-Glutamine) 56-85-9 292.00
L-ヒスチジン塩酸塩一水和物(L-Histidine HCl H2O) 7048-02-4 41.90
L-イソロイシン(L-Isoleucine) 73-32-5 52.50
L-ロイシン(L-Leucine) 61-90-5 52.50
アミノ酸 L-リジン塩酸塩(L-Lysine HCl) 657-27-2 72.50
L-メチオニン(L-Methionine) 63-68-3 15.00
L-フェニルアラニン(L-Phenylalanine) 63-91-2 32.50
L-トレオニン(L-Threonine) 72-19-5 47.60
L-トリプトファン(L-Tryptophan) 73-22-3 10.00
122666-87-9
L-チロシン二ナトリウム二水和物(L-Tyrosine 2Na 2H2O) 51.90
L-バリン(L-Valine) 72-18-4 46.80
コリンクロリド(Choline Chloride) 67-48-1 1.00
パントテン酸カルシウム(D Calcium Pantothenate) 137-08-6 1.00
葉酸水和物(Folic Acid) 59-30-3 1.00
イノシット(Myo Inositol) 87-89-8 2.00
ビタミン
ニコチン酸アミド(Nicotinamide) 98-92-0 1.00
ピリドキシン塩酸塩(Pyridoxine HCl) 58-56-0 1.00
リボフラビン(Riboflavin) 83-88-5 0.10
塩酸チアミン(Thiamine HCl) 67-03-8 1.00
塩化カルシウム(Calcium Chloride) 10043-52-4 200.00
7487-88-9
硫酸マグネシウム(無水)(Magnesium Sulfate[Anhydrous]) 97.70
塩化カリウム(Potassium Chloride) 7447-40-7 400.00
無機塩
塩化ナトリウム(Sodium Chloride) 7647-14-5 6 800.00
りん酸二水素ナトリウム一水和物(Sodium Phosphate 10049-21-5 140.00
Monobasic Monohydrate)
D-グルコース(D-Glucose) 50-99-7 1 000.00
その他
34487-61-1
フェノールレッドナトリウム(Phenol Red Sodium Salt) 10.00
――――― [JIS L 1922 pdf 27] ―――――
25
L 1922 : 2016
D.3 RPMI 1640 培地の組成
RPMI 1640培地は,市場で入手できる。その成分例を,表D.2に示す。
表D.2−RPMI 1640培地の組成
水1 000 mL中の組成 CAS No. mg
L-アルギニン(L-Arginine[Free Base]) 74-79-3 200.00
L-アスパラギン(無水)(L-Asparagine[Anhydrous]) 70-47-3 50.00
L-アスパラギン酸(L-Aspartic Acid) 56-84-8 20.00
L-シスチン二塩酸塩(L-Cystine 2HCl) 30925-07-6 65.20
L-グルタミン酸(L-Glutamic Acid) 56-86-0 20.00
L-グルタミン(L-Glutamine) 56-85-9 300.00
グリシン(Glycine) 56-40-6 10.00
L-ヒスチジン(L-Histidine[Free Base]) 71-00-1 15.00
L-ヒドロキシプロリン(Hydroxy-L-Proline) 51-35-4 20.00
L-イソロイシン(L-Isoleucine) 73-32-5 50.00
アミノ酸
L-ロイシン(L-Leucine) 61-90-5 50.00
L-リジン塩酸塩(L-Lysine HCl) 657-27-2 40.00
L-メチオニン(L-Methionine) 63-68-3 15.00
L-フェニルアラニン(L-Phenylalanine) 63-91-2 15.00
L-プロリン(L-Proline) 147-85-3 20.00
L-セリン(L-Serine) 56-45-1 30.00
L-トレオニン(L-Threonine) 72-19-5 20.00
L-トリプトファン(L-Tryptophan) 73-22-3 5.00
122666-87-9
L-チロシン二ナトリウム二水和物(L-Tyrosine 2Na 2H2O) 28.83
L-バリン(L-Valine) 72-18-4 20.00
ビオチン(Biotin) 58-85-5 0.20
コリンクロリド(Choline Chloride) 67-48-1 3.00
葉酸水和物(Folic Acid) 59-30-3 1.00
イノシット(Myo Inositol) 87-89-8 35.00
ニコチン酸アミド(Nicotinamide) 98-92-0 1.00
ビタミン パントテン酸カルシウム(D Calcium Pantothenate) 137-08-6 0.25
p-アミノ安息香酸(p-Aminobenzoic Acid) 150-13-0 1.00
ピリドキシン塩酸塩(Pyridoxine HCl) 58-56-0 1.00
リボフラビン(Riboflavin) 83-88-5 0.20
塩酸チアミン(Thiamine HCl) 67-03-8 1.00
ビタミンB12(Vitamin B12) 68-19-9 0.005
二硝酸カルシウム四水和物(Calcium Nitrate 4H2O) 13477-34-4 100.00
7487-88-9
硫酸マグネシウム(無水)(Magnesium Sulfate[Anhydrous]) 48.84
塩化カリウム(Potassium Chloride) 7447-40-7 400.00
無機塩
塩化ナトリウム(Sodium Chloride) 7647-14-5 6 000.00
りん酸ナトリウム(無水)(Sodium Phosphate 7558-79-4 800.00
Dibasic[Anhydrous])
D-グルコース(D-Glucose) 50-99-7 2 000.00
その他 グルタチオン(還元型)(Glutathione, Reduced) 70-18-8 1.00
34487-61-1
フェノールレッドナトリウム(Phenol Red Sodium Salt) 5.30
――――― [JIS L 1922 pdf 28] ―――――
26
L 1922 : 2016
附属書E
(参考)
ポリオウイルス
E.1 概要
ポリオウイルスは,化学物質に対する高い耐性をもち,酸に対して安定性があり,また,エーテルのよ
うな有機溶媒,界面活性剤及び4級塩による影響を受けないため,試験ウイルスとして選択される。
ポリオウイルスは,インフルエンザ及びネコカリシよりも小さなウイルスである。
この規格では,エンベロープウイルスであるインフルエンザ及び非エンベロープであるネコカリシの二
つのウイルスを選択している。しかし,非エンベロープのポリオウイルスが,並行して試験に用いられて
いる。この附属書は,このポリオウイルスのための情報及び試験方法について記載する。
E.2 ポリオウイルス株及び宿主細胞
ポリオウイルス株及び宿主細胞を,表E.1に示す。
表E.1−ポリオウイルス株及び宿主細胞
ウイルスの種類 ポリオウイルス
ウイルス株 Poliovirus type1 LSc-2ab
(WHO標準に準拠した経口生ポリオワクチン)
宿主細胞 HEp-2 cell
(ヒト咽頭がん細胞起源)
ATCC CCL-23
培地 EMEM(9.8.1)
E.3 試験条件
この試験のための全ての条件は,ネコカリシウイルスの場合と同様である。
――――― [JIS L 1922 pdf 29] ―――――
27
L 1922 : 2016
附属書F
(参考)
発育鶏卵を使用したウイルス感染価測定方法
F.1 概要
ウイルス感染価測定方法として発育鶏卵を使用する方法がある。この方法は,特にウイルスの感染によ
る疾病用ワクチン製造に使用されている。この規格に記載しているように,発育鶏卵のような生体を使用
しない培養細胞を使用する方法が一般的である。しかし,この発育鶏卵法は,ワクチン製造では幾つかの
試験機関で使用されている方法であるため,この附属書に参考として記載する。
F.2 適用範囲
この附属書は,繊維製品用のSPF発育鶏卵を用いるウイルス感染価の測定方法について記載する。
F.3 用語及び定義
F.3.1
SPF発育鶏卵(SPF embryonated hen's eggs)
ワクチン製造用に使用する病原性微生物に感染した経験のない鶏卵をいい,この附属書の測定で使用す
る。SPFは,特定病原体フリー(specfic pathogen free)に由来する。
F.4 試料の準備
F.4.1 試料から試験片を0.2 g採取する。試験片の数は3とする。
F.4.2 試料が織物,編物,不織布などのシート状のものの場合は,0.2 gを採取し,15 mm角に切りそろ
えて重ねる。
F.4.3 ポリエチレン製のチャック付き袋に入れる。
注記 試験前にオートクレーブなどによる試料の滅菌は,実施しない。
F.5 発育鶏卵の準備
10日齢のSPF発育鶏卵を準備する。
F.6 試験ウイルスの準備
インフルエンザウイルスは,ニワトリ胚適合株A/PR/8/34(H1N1),A/Aichi/3/68(H3N2)を使用する。
F.6.1 ウイルスの培養
F.6.1.1 ウイルス液の0.2 mLを,F.5の発育鶏卵のしょう(漿)尿膜腔内に接種する。
F.6.1.2 接種後,35 ℃の温度に設定されたインキュベーター(7.25)で3日間培養を行う。
F.6.1.3 その後,鶏卵を冷蔵庫で一晩冷却後に,しょう(漿)尿液を採取する。
F.6.1.4 採取したしょう(漿)尿液について,インフルエンザウイルスの増殖確認の検査を行う。感染し
た場合は,凝集が観察される。感染を確認後,その尿液をウイルス液又はウイルス培地とみなす。
F.6.1.5 試験を実施する直前に,ウイルス液を約107 EID50 / 0.2 mLのウイルス濃度になるように,pH 7.2
のりん酸緩衝生理食塩水(以下,PBSという。)で調製する。
――――― [JIS L 1922 pdf 30] ―――――
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JIS L 1922:2016の引用国際規格 ISO 一覧
- ISO 18184:2014(MOD)
JIS L 1922:2016の国際規格 ICS 分類一覧
JIS L 1922:2016の関連規格と引用規格一覧
- 規格番号
- 規格名称
- JISK3600:2000
- バイオテクノロジー用語
- JISK8008:1992
- 生化学試薬通則
- JISL0803:2011
- 染色堅ろう度試験用添付白布