JIS L 1922:2016 繊維製品の抗ウイルス性試験方法 | ページ 5

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L 1922 : 2016
  図4の例による感染価の計算例は,次による。
                        X=100=1
                         p=(8/8+7/8+4/8+1/8+0/8)=2.5
                        a= p−0.5=2.5−0.5=2.0
  よって,
                        Y=X×10a=1×102.0=1.0×102(TCID50/0.1 mL)
                        A=Y×10=1×103(TCID50/mL)
                        V=A×C=A×20=1×103×20=2.0×104(TCID50/試験片)

14.3 試験結果

14.3.1 試験成立の判定
  次のいずれにも該当する場合に,試験が成立していると判定する。
a) 試験ウイルス懸濁液の感染価
− インフルエンザウイルス懸濁液濃度 >107 PFU/mL又はTCID50/mL
− ネコカリシウイルス懸濁液濃度 >107 PFU/mL又はTCID50/mL
b) 10.6によって,試験片の加工剤活性の抑制効果が確認されている。
c) 次の式(4)よって算出された対照試料の感染価の減少値を四捨五入によって小数点以下1桁に丸めたと
    き,その値が 1.0 以下である。
                        M     (Va /Vb) log
                            log                 (Vb) (4)
                                         (Va ) log
                      ここに,         M :  対照試料の感染価の減少値
                                   log(Va) :  対照試料の試験ウイルス懸濁液接種直後の3検体の感染
                                             価常用対数の平均値
                                   log(Vb) :  対照試料の2時間作用後の3検体の感染価常用対数の平
                                             均値
    注記 11.3の作用時間が24時間の場合は,対照試料の感染価の減少値は,2.0以下であることが望ま
          しい。
14.3.2 抗ウイルス活性値の計算
  次の式(5)によって抗ウイルス活性値を計算し,四捨五入法によって小数点以下1桁に丸める。
                        Mv   log Vb /Vclog Vb  log Vc  (5)
                      ここに,        Mv :  抗ウイルス活性値
                                   log(Vb) :  対照試料の2時間作用後の3検体の感染価常用対数の平
                                             均値
                                   log(Vc) :  抗ウイルス試料の2時間作用後の3検体の感染価常用対
                                             数の平均値
    注記 Mが1.0未満,かつ,log(Va)がlog(Vb)を超える場合は,log(Vb)をlog(Va)に置き換えて計算して
          もよい。

15 試験報告書

  試験報告書には次の事項を記載する。
a) 規格番号

――――― [JIS L 1922 pdf 21] ―――――

                                                                                             19
                                                                                   L 1922 : 2016
b) 試験試料の明細
c) 試験ウイルス株の明細
d) 試験結果
e) 規定から逸脱した内容

――――― [JIS L 1922 pdf 22] ―――――

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L 1922 : 2016
                                          附属書A
                                         (規定)
                          試験対象ウイルス株及び宿主細胞
A.1 試験対象ウイルス株及び宿主細胞
  この規格で使用するウイルス株及び宿主細胞を,表A.1に示す。
                        表A.1−試験対象ウイルス株,宿主細胞及び増殖培地
              対象             インフルエンザウイルス            ネコカリシウイルス
            ウイルス
           ウイルス株       Influenza A virus(H3N2): A/Hong Feline calicivirus; Strain: F-9 ATCC
                                Kong/8/68: TC adapted               ATCC VR-782
                                   ATCC VR-1679
                           Influenza A virus (H1N1): A/PR/8/34:
                                     TC adapted
                                   ATCC VR-1469,
           宿主細胞a)               MDCK 細胞                       CRFK 細胞
                                (イヌ腎臓由来細胞)            (ネコ腎臓由来細胞)
                                    ATCC CCL-34                     ATCC CCL-94
           増殖培地b)               EMEM (9.7)                    RPMI 1640 (9.7)
       注a) 他の宿主細胞は,各ウイルスに対する感受性に関する適切な検証後に使用することができる。
          b) 他の増殖培地は,細胞の増殖に関する適切な検証の後に使用することができる。

――――― [JIS L 1922 pdf 23] ―――――

                                                                                             21
                                                                                   L 1922 : 2016
                                          附属書B
                                          (規定)
                                      プラーク測定法
B.1   試験手順
B.1.1 10.3の6穴プラスチックプレートに,単層培養した細胞が均一に分布していることを倒立顕微鏡
(7.16)で確認した後,増殖培地を除去する。
B.1.2 維持培地(9.8)3 mLを加え,細胞表面を洗浄した後,余分な維持培地を除去する。この操作を2
回繰り返し,細胞表面を洗浄する。
B.1.3 洗い出し液の各希釈系列0.1 mLを1希釈系列当たり2穴ずつ,細胞表面に接種する。すなわち,
最初の2穴には洗い出し原液を接種し,次の2穴には1/10希釈ウイルス懸濁液を接種する。最後の列には,
細胞を検証するため,維持培地(9.8)0.1 mLを接種する。
B.1.4 B.1.3のプレートを表B.1の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,15分ごとに
プレートを揺すりながら,1時間保温し,ウイルスを細胞全体に吸着させる。
B.1.5 B.1.4のプレートに維持培地(9.8)3 mLを加え,表面を洗浄した後,余分な維持培地を除去する。
B.1.6 各穴にプラーク測定法用の寒天培地(9.14)3 mLを加え,蓋をして室温で約10分間静置する。
B.1.7 寒天培地が凝固したことを確認後,プレートを倒置し,表B.1の温度に設定されたCO2インキュベ
ーター(7.24)によって,2日3日間培養する。
  培養後,CO2インキュベーター(7.24)からプレートを取り出し,元の向きに戻し,各穴に寒天上から,
細胞固定用ホルマリン溶液(9.4)3 mLを加え,室温で1時間以上静置し,細胞を固定する。
    注記 細胞固定に関する適切な検証後,他の細胞固定液を使用することができる。
B.1.8 細胞固定後,B.1.7から寒天培地を除去し,各穴に細胞染色用メチレンブルー溶液(9.5)3 mLを加
え,室温で15分間以上静置し,細胞を染色する。
B.1.9 染色後の余分なメチレンブルー溶液を流水で洗い流し,細胞の染色を確認する(図B.1参照)。
B.1.10 プラーク(白い斑点)数を測定する。
B.1.11 2穴のプラーク数の平均値を算出する。
                                 図B.1−プラーク測定法の写真例

――――― [JIS L 1922 pdf 24] ―――――

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L 1922 : 2016
                             表B.1−CO2インキュベーターの設定条件
            試験対象ウイルス         インフルエンザウイルス         ネコカリシウイルス
              規定箇条番号                            10.4.4.2.1及び13.1
           吸着温度設定(℃)
                                              34                           37
           培養温度設定(℃)
B.2   プラーク数(PFU)の測定
B.2.1 概要
  プラーク(白い斑点)は,60個程度まで数えることができる。60個以上になるとプラーク(白い斑点)
の分離が不明確になる。また,別のケースとして,プラークが確認されない場合がある。その場合は,2
穴の平均が1以下になることがある。そのため,プラーク数(PFU)の決定は,B.2.2による。
B.2.2 プラーク数(PFU)の決定
  この規格に規定しているように,プラークは希釈系列の染色された細胞上の斑点として数えられる。プ
ラーク数は,表B.2の規定によってそれぞれの希釈倍率での二つのデータの平均として得られる。
                                      表B.2−データの解釈
               希釈系列    洗い出し原液  第1希釈     第2希釈    第3希釈    第N希釈
           希釈倍率             1          10倍       100倍      1 000倍    10N倍
           平均プラーク数       C1          C2         C3          C4         CN
  プラーク数は,次のように決定する。
− C1からCNの一つの系列で,660のプラーク数が得られた場合は,その値をその試験のプラーク数
    (PFU)とする。
− C1が6以下の場合は,C1をその試験のプラーク数(PFU)とする。
− C1が0を含めて1以下の場合は,プラーク数(PFU)を1として計算する。

――――― [JIS L 1922 pdf 25] ―――――

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