JIS L 1922:2016 繊維製品の抗ウイルス性試験方法 | ページ 3

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− りん酸二水素カリウム                                 0.2 g
9.10.2 9.10.1の成分を溶解,混合し,水(9.1)を加えて全量を1 000 mLとする。
9.10.3 9.10.2の混合溶液を培地瓶(7.27)に移し,オートクレーブ(7.1)によって121 ℃,103 kPaの条
件で高圧蒸気滅菌を行う。
9.11 ウシすい(膵)臓由来トリプシン及びPBS (-) 混合液
9.11.1 ビーカーを準備し,次の成分を入れる。
− 0.01 mol/Lのりん酸緩衝生理食塩水[PBS(-)](9.10)   100 mL
− ウシすい(膵)臓由来トリプシン                       1.0 g
9.11.2 9.11.1の成分を2時間溶解し,混合する。
9.11.3 9.11.2の混合溶液を,孔径0.22 μmのメンブランフィルタ(7.13)によって,ろ過滅菌する。適量
ずつ分注し,すぐ使用しないものは−80 ℃以下の温度に設定された冷凍庫(7.11)に入れ,保存する。
9.11.4 試験管を準備し,次の成分を入れる。
− 0.01 mol/Lのりん酸緩衝生理食塩水[PBS(-)](9.10)   9 mL
− ウシすい(膵)臓由来トリプシン及びPBS(-) 混合液 (9.11) 1 mL
9.11.5 9.11.4の成分を十分に溶解し,混合する。
9.11.6 混合溶液を適量ずつ分注し,−20 ℃以下の温度に設定された冷凍庫(7.11)に入れ,保存する。
9.11.7 使用直前に37 ℃の温度に設定されたウォーターバス(7.9)によって解凍する。
9.12 結晶トリプシン及びエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液
9.12.1 1 Lのメスフラスコ(7.3)を準備し,次の成分を入れる。
− 0.01 mol/Lのりん酸緩衝生理食塩水[PBS(-)](9.10)   800 mL
− 結晶トリプシン                                       2.5 g
− カナマイシン硫酸塩                                   0.1 g
− ストレプトマイシン硫酸塩                             0.1 g
− アムホテリシンB                                      2 mg
− EDTA                                                 0.014 mol
9.12.2 9.12.1の成分を溶解,混合し,0.01 mol/Lのりん酸緩衝生理食塩水[PBS(-)](9.10)を加えて全量
を1 000 mLとする。
9.12.3 9.12.2の混合溶液を,孔径0.22 μmのメンブランフィルタ(7.13)によって,ろ過滅菌する。
9.12.4 混合溶液を適量ずつ分注し,−20 ℃以下の温度に設定された冷凍庫(7.11)に入れ,保存する。
9.12.5 使用直前に,37 ℃の温度に設定されたウォーターバス(7.9)によって解凍する。
    注記 結晶トリプシン及びEDTA溶液は市場で購入できる。
            なお,購入したものが9.12.1と成分が異なる場合でも適切な検証後に使用可能である。
9.13 ジエチルアミノエチルデキストラン(DEAE-Dextran)溶液
9.13.1 1 Lのメスフラスコ(7.3)を準備し,次の成分を入れる。
− 水(9.1)                                            800 mL
− DEAE-Dextran                                         20 g
9.13.2 9.13.1の成分を溶解,混合し,水(9.1)を加えて全量を1 000 mLとする。
9.13.3 9.13.2の混合溶液を,孔径0.22 μmのメンブランフィルタ(7.13)によって,ろ過滅菌する。
9.14 寒天培地
  寒天培地は,プラーク測定法に使用するものであり,A液及びB液を次の処方によって準備し,使用直

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                                                                                   L 1922 : 2016
前に十分に混合する。
9.14.1 A液
9.14.1.1 1 Lの滅菌済み培地瓶(7.27)を準備し,次の成分を入れて十分混合する。
− 2倍濃縮維持培地(9.9)                               1 000 mL
− DEAE-Dextran溶液(9.13)                             10 mL
− 7.5 % 炭酸水素ナトリウム溶液(9.3)                  40 mL
9.14.1.2 インフルエンザウイルスのプラーク測定法の場合だけ,ウシすい(膵)臓由来トリプシン(9.11)
を3.0 mL加える。
9.14.1.3 9.14.1.1及び9.14.1.2の混合溶液を37 ℃の温度に設定されたウォーターバス(7.9)に入れ,使用
直前まで保温する。
9.14.2 B液
9.14.2.1 2 Lの培地瓶(7.27)を準備し,次の成分を入れて十分混合する。
− 水(9.1)                                            1 000 mL
− 細胞培養用寒天                                       15 g
9.14.2.2 9.14.2.1の混合溶液をオートクレーブ(7.1)によって121 ℃,103 kPaの条件で,15分間高圧蒸
気滅菌する。
9.14.2.3 9.14.2.2の混合溶液を50 ℃の温度に設定されたウォーターバス(7.9)に入れ,使用直前まで保
温する。
9.15 SCDLP培地
  SCDLP培地は,繊維上のウイルスの洗い出し処理及び試験試料に加工されている薬剤の不活性化のため
に使用する。
9.15.1 1 Lの培地瓶(7.27)を準備し,次の成分を入れて溶解し,十分混合する。
− 水(9.1)                                            1 000 mL
− カゼイン製ペプトン                                   17.0 g
− 大豆製ペプトン                                       3.0 g
− 塩化ナトリウム                                       5.0 g
− りん酸水素二カリウム                                 2.5 g
− グルコース                                           2.5 g
− レシチン                                             1.0 g
− 非イオン界面活性剤[ポリソルベート80(Tween 80)]   7.0 g
9.15.2 9.15.1の混合溶液を25 ℃の温度に設定されたウォーターバス(7.9)によって水酸化ナトリウム溶
液又は塩酸溶液によってpH 7.0±0.2,25 ℃に調製する。
9.15.3 9.15.2の調製液をオートクレーブ(7.1)によって,121 ℃,103 kPaの条件下で15分間高圧蒸気滅
菌を行う。
9.16 TCID50測定法に用いる維持培地
9.16.1 1 Lの培地瓶(7.27)を準備し,次の成分を入れて溶解し,十分混合する。
− 維持培地(9.8)                                      1 000 mL
− ウシすい(膵)臓由来トリプシン(9.11)               3.0 mL

――――― [JIS L 1922 pdf 12] ―――――

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10 試験準備

10.1 凍結保存された宿主細胞の復元

  凍結保存された宿主細胞は,解凍し,培養を行う。その手順は,次による。
10.1.1 凍結保存された宿主細胞懸濁液を37 ℃の温度に設定されたウォーターバス(7.9)によって,急速
に融解する。
10.1.2 フラスコ(7.23)に増殖培地(9.7)20 mLを加える。
10.1.3 10.1.2のフラスコに10.1.1によって融解した細胞を1アンプル分全量を入れる。
10.1.4 10.1.3のフラスコを,37 ℃の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,24時間±2
時間培養する。
10.1.5 倒立顕微鏡(7.16)によってフラスコ(10.1.4)底部に細胞が吸着していることを確認する。確認
できれば次の手順を行う。確認できない場合は,更に培養を継続する。
10.1.6 10.1.5のフラスコ内の増殖培地を全量除去する。
10.1.7 10.1.6のフラスコ内に新たに増殖培地(9.7)20 mLを加える。
10.1.8 10.1.7のフラスコを,37 ℃の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,48時間±2
時間培養する。
10.1.9 培養後,細胞が10.1.8のフラスコの底面に均一に分布していることを倒立顕微鏡(7.16)によって
確認する。細胞の増殖が不十分な場合は,十分に増殖したことが確認できるまで継続する。
10.1.10 次に,10.2の手順によって,継代培養を行う。

10.2 宿主細胞の継代培養

  宿主細胞は,継代培養する。継代培養の手順は,次による。
10.2.1 10.1.9で単層培養した細胞が,フラスコの底面に均一に分布していることを倒立顕微鏡(7.16)に
よって確認する。確認後,増殖培地を除去する。
10.2.2 次に,0.01 mol/Lのりん酸緩衝生理食塩水[PBS(-)]5 mLを加え,この溶液によってフラスコ底部
上に増殖した細胞の表面を洗浄後,加えたPBS(-)を除去する。この操作を3回繰り返す。
10.2.3 10.2.2のフラスコに結晶トリプシン及びEDTA溶液(9.12)1 mLを加え,細胞表面全体に行き渡ら
せた後,余分な結晶トリプシン及びEDTA溶液を除去する。
10.2.4 10.2.3のフラスコを37 ℃の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,10分間±1
分間保温する。
10.2.5 10.2.4のフラスコ内の細胞ががれ始めたことを目で確認し,フラスコ側面を軽くたたき,細胞を
分散させる。
10.2.6 10.2.5のフラスコに増殖培地(9.7)5 mLを加える。組織を傷付けないようにピペットによってピ
ペッティングし,細胞を分散させる。
10.2.7 新らたな細胞培養用フラスコ(7.23)に増殖培地20 mLを加えたものを準備する。
10.2.8 10.2.7のフラスコ内にピペットによって,10.2.6の細胞懸濁液を1 mL加える。
10.2.9 蓋を締めたフラスコを37 ℃の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,5日間3)
培養する。
    注記 継代培養を繰り返し行う場合は,10.2.110.2.9の工程を繰り返す。
    注3) 培養期間は,必要に応じて変更してもよい。

10.3 ウイルス感染価測定用細胞培養

  プラーク測定法又はTCID50測定法のために,6穴プラスチックプレート又は96穴マイクロプレートに

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                                                                                             11
                                                                                   L 1922 : 2016
よって,細胞培養する。
10.3.1 培地瓶(7.27)に増殖培地(9.7)を20 mL入れ,ピペットによって10.2.6の細胞懸濁液を1 mL加
える。
10.3.2 プラーク測定法用の6穴プラスチックプレート(7.22)には,10.3.1の細胞懸濁液を1穴当たり,3
mL加える。
10.3.3 TCID50測定法用の96穴マイクロプレート(7.21)には,10.3.1の細胞懸濁液を1穴当たり,0.1 mL
加える。
10.3.4 10.3.2の6穴プラスチックプレート又は10.3.3の96穴マイクロプレートを,37 ℃の温度に設定さ
れたCO2インキュベーター(7.24)に入れて,5日間4)培養する。
    注4) 培養期間は,必要に応じて変更してもよい。
10.3.5 感染価の測定に使用する前に,倒立顕微鏡(7.16)によって,細胞が均一に分布していることを確
認する。

10.4 試験ウイルス懸濁液の調製

10.4.1 概要
  ウイルスは凍結保存されているので,その融解及び培養を行う。
10.4.2 インフルエンザウイルス
10.4.2.1 凍結保存されたウイルス懸濁液を37 ℃の温度に設定されたウォーターバス(7.9)によって,急
速に融解する。
10.4.2.2 細胞が単層培養された10.2.9のフラスコから増殖培地を除去する。
10.4.2.3 10.4.2.2のフラスコ内に5 mLの維持培地(9.8)を加えて細胞の表面を洗浄後,維持培地を除去す
る。この洗浄操作を2回繰り返す。
10.4.2.4 新しい試験管を準備する。
10.4.2.5 10.4.2.4の試験管に10.4.2.1の融解したインフルエンザウイルス懸濁液を入れ,維持培地(9.8)
によって希釈し,103 PFU(プラーク形成単位であり,以下,PFUという。)/mL104 PFU/mL又はTCID50/mL
に調製する。
10.4.2.6 10.4.2.3のフラスコ内の細胞の表面上に10.4.2.5で調製されたインフルエンザウイルス懸濁液1
mLを接種し,細胞表面全体に広げる。
10.4.2.7 10.4.2.6のフラスコを34 ℃の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,1時間保
温し,細胞にウイルスを吸収させる。
10.4.2.8 10.4.2.7のフラスコ内に維持培地(9.8)20 mLを入れ,更にウシすい(膵)臓由来トリプシン及
びPBS(-)混合液(9.11)30 μLを加える。
10.4.2.9 10.4.2.8のフラスコを34 ℃の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,フラスコ
内のインフルエンザウイルスを1日3日間増殖させる。
10.4.2.10 倒立顕微鏡(7.16)によって細胞変性効果を観察し,インフルエンザウイルスの増殖を確認する。
インフルエンザウイルスの増殖が確認された場合は,次のステップへ進む。
10.4.2.11 遠沈管(7.26)に,培養されたウイルス懸濁液を入れる。
10.4.2.12 遠心分離機(7.18)によって,10.4.2.11のウイルス懸濁液を4 ℃の温度で15分間,約9 800 m/s2
(1 000 g)の条件下で遠心分離する。
10.4.2.13 遠心分離後,遠沈管から上澄みを取る。これを,インフルエンザウイルスの懸濁液とする。試
験管に適量を分注し,−80 ℃の温度に設定された冷凍庫(7.11)に入れ,凍結保存する。

――――― [JIS L 1922 pdf 14] ―――――

12
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10.4.2.14 プラーク測定法又はTCID50測定法によって,ウイルス懸濁液の濃度が107 PFU/mL以上又は
TCID50/mL以上かどうかを確認する。ウイルス懸濁液の濃度が107 PFU/mL未満又はTCID50/mL未満の場
合は,再度調製する。
10.4.2.15 10.4.2.14で凍結保存したウイルス懸濁液を使用直前に,37 ℃の温度に設定されたウォーターバ
ス(7.9)によって,急速に融解する。
10.4.2.16 これを試験ウイルス懸濁液とする。直ちに使用しない場合は,4 ℃の温度に設定された保冷庫
(7.14)に入れ,保存する。
    注記1 10.4.2.16の試験ウイルス懸濁液は,必要に応じて使用直前に,水(9.1)で10倍希釈しても
            よい。
    注記2 10倍希釈後の試験ウイルス懸濁液の濃度は,1×107 PFU/mL5×107 PFU/mL又はTCID50/mL
            であることが望ましい。
10.4.3 ネコカリシウイルス
10.4.3.1 凍結保存されたウイルス懸濁液を37 ℃の温度に設定されたウォーターバス(7.9)によって,急
速に融解する。
10.4.3.2 細胞が単層培養された10.2.9のフラスコから増殖培地を除去する。
10.4.3.3 10.4.3.2のフラスコ内に,5 mLの維持培地(9.8)を加えて培養細胞の表面を洗浄後,維持培地を
除去する。この洗浄操作を2回繰り返す。
10.4.3.4 新しい試験管を準備する。
10.4.3.5 10.4.3.4の試験管に10.4.3.1で融解したネコカリシウイルス懸濁液を入れ,維持培地(9.8)によ
って希釈し,105 PFU/mL106 PFU/mL又はTCID50/mLに調製する。
    注記 ウイルス懸濁液濃度は,必要に応じて変更してもよい。
10.4.3.6 10.4.3.3のフラスコ内の細胞の表面上に,10.4.3.5で調製されたネコカリシウイルス懸濁液1 mL
を接種し,細胞表面全体に広げる。
10.4.3.7 10.4.3.6のフラスコを37 ℃の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,1時間保
温し,細胞にウイルスを吸収させる。
10.4.3.8 10.4.3.7のフラスコ内に,維持培地(9.8)20 mLを追加する。
    注記 加える維持培地は,必要に応じて変更してもよい。
10.4.3.9 10.4.3.8のフラスコを37 ℃の温度に設定されたCO2インキュベーター(7.24)に入れ,フラスコ
内のネコカリシウイルスを1日3日間増殖させる。
10.4.3.10 倒立顕微鏡(7.16)によって細胞変性効果を観察し,ネコカリシウイルスの増殖を確認する。
ネコカリシウイルスの増殖が確認された場合は,次のステップへ進む。
10.4.3.11 遠沈管(7.26)に,培養されたウイルス懸濁液を入れる。
10.4.3.12 遠心分離機(7.18)によって,10.4.3.11のウイルス懸濁液を4 ℃の温度で15分間,約9 800 m/s2
(1 000 g)の条件下で遠心分離する。
10.4.3.13 遠心分離後,遠沈管から上澄み液を取る。これを,ネコカリシウイルスの懸濁液とする。試験
管に適量を分注し,−80 ℃の温度に設定された冷凍庫(7.11)に入れ,凍結保存する。
10.4.3.14 プラーク測定法又はTCID50測定法によって,ネコカリシウイルス懸濁液の濃度が107 PFU/mL
以上又はTCID50/mL以上かどうかを確認する。ウイルス懸濁液の濃度が107 PFU/mL未満又はTCID50/mL
未満の場合は,再度調製する。
10.4.3.15 10.4.3.14の凍結保存したウイルス懸濁液を使用直前に,37 ℃の温度に設定されたウォーターバ

――――― [JIS L 1922 pdf 15] ―――――

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