JIS K 3703-2:2004 コアグラーゼ陽性ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌など）の菌数測定方法－第２部：ウサギ血しょう(漿)フィブリノーゲン寒天培地

                                                                                 K 3703-2 : 2004

まえがき

  この規格は,工業標準化法第12条第1項の規定に基づき,財団法人バイオインダストリー協会(JBA)/
財団法人日本規格協会(JSA)から,工業標準原案を具して日本工業規格(日本産業規格)を制定すべきとの申出があり,日本
工業標準調査会の審議を経て,経済産業大臣が制定した日本工業規格(日本産業規格)である。
  制定に当たっては,日本工業規格(日本産業規格)と国際規格との対比,国際規格に一致した日本工業規格(日本産業規格)の作成及び日
本工業規格を基礎にした国際規格原案の提案を容易にするために,ISO 6888-2:1999,Microbiology of food
and animal feeding stuffs−Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci
(Staphylococcus aureus and other species)−Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar mediumを基礎
として用いた。
  この規格の一部が,技術的性質をもつ特許権,出願公開後の特許出願,実用新案権,又は出願公開後の
実用新案登録出願に抵触する可能性があることに注意を喚起する。経済産業大臣及び日本工業標準調査会
は,このような技術的性質をもつ特許権,出願公開後の特許出願,実用新案権又は出願公開後の実用新案
登録出願にかかわる確認について,責任はもたない。
  JIS K 3703-2には,次に示す附属書がある。
    附属書(参考) JISと対応する国際規格との対比表
  JIS K 3703の規格群には,次に示す部編成がある。
    JIS K 3703-1 第1部 : ベアード・パーカー寒天培地
    JIS K 3703-2 第2部 : ウサギ血しょう(漿)フィブリノーゲン寒天培地

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K3703-2:2004

pdf 目 次

ページ

•  0. 序文・・・・[1]
•  1. 適用範囲・・・・[2]
•  2. 引用規格・・・・[2]
•  3. 定義・・・・[2]

4. 一般原則     2
5. 希釈液及び寒天培地        3
6. 装置及びガラス器具        4

•  7. 試料の採取・・・・[4]
•  8. 試料の調製・・・・[4]
•  9. 実施手順 410. 結果の表示・・・・[5]
•  11. 精度・・・・[6]
•  12. 試験報告書・・・・[6]
•  参考文献・・・・[7]
•  附属書(参考)JISと対応する国際規格との対比表・・・・[8]

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                                       日本工業規格(日本産業規格)                             JIS
                                                                           K 3703-2 : 2004

コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定方法−第2部 : ウサギ血しょう(漿)フィブリノーゲン寒天培地

Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci(Staphylococcus aureus and other species)-Part 2:Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium

0. 序文

 この規格は,1999年に第1版として発行されたISO 6888-2:1999,Microbiology of food and animal
feeding stuffs−Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus
and other species)−Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar mediumを翻訳し,技術的内容を変更し
て作成した日本工業規格(日本産業規格)である。
  なお,この規格で点線の下線を施してある箇所は,原国際規格を変更している事項である。変更の一覧
表をその説明を付けて,附属書(参考)に示す。

1. 適用範囲

 この規格は,ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地(以下、寒天培地という。)を用い
て35 ℃又は37 ℃で好気的に培養して得られるコロニー数を測定する方法について規定する。
  この規格は、人が摂取する食品及び動物用飼料(これらは、工業標準化法の適用対象となるものに限る。)
中に存在するコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の菌数測定を目的とする[参考文献1)]。
 食品及び動物用飼料には多種多様な製品が存在するため,特定の製品に関しては,この測定方法がすべ
てに適しているとは限らない。その場合,正当な技術的理由があれば,このような製品に限定される別の
方法を用いてもよい。しかし,可能な限りこの測定方法を適用するように努めなければならない。
 JIS K 3703規格群で,エンテロトキシン産生株を含むコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の菌数測定方法につ
いて二つの測定方法(JIS K 3703-1及びJIS K 3703-2)を規定している。主に黄色ブドウ球菌(Staphylococcus
aureus)が対象であるが,S. intermedius 及び S. hyicus の一部も対象となる。
  一般的にはJIS K 3703-1をエンテロトキシン産生株を含むコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の菌数測定に適
用する。しかし,次に示す菌によって汚染される可能性のある食材(生乳から製造されたチーズ及び生肉
製品など工業標準化法の対象とならないものは除く。)に限っては,JIS K 3703-2に示す手順を適用するこ
とが望ましい。
− ベアード・パーカー寒天培地上に非定形コロニーを形成するブドウ球菌
− 求めるコロニーが埋もれてしまうようなバックグラウンド・フローラ〔細菌そう(叢)〕
 JIS K 3703-2では,ブドウ球菌の確認はコアグラーゼ陽性反応に基づいている。しかし,黄色ブドウ球
菌にはコアグラーゼ陽性反応が弱い菌株があることが知られている。この反応の弱い菌株は他の細菌と混

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2
K 3703-2 : 2004
同される可能性があるが,JIS K 3703-2には含まれていない試験を追加することによって識別することが
できる。その試験法には,リゾスタフィンの感受性,溶血性毒素の産生,耐熱性ヌクレアーゼの産生,マ
ンニトール分解による酸産生の試験などがある〔参考文献2〕。
    備考 この規格の対応国際規格を,次に示す。
            なお,対応の程度を表す記号は,ISO/IEC Guide 21に基づき,IDT(一致している),MOD
          (修正している),NEQ(同等でない)とする。
          ISO 6888-2:1999,Microbiology of food and animal feeding stuffs−Horizontal method for the
              enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)−Part
              2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium (MOD)

2. 引用規格

 次に掲げる規格は,この規格に引用されることによって,この規格の規定の一部を構成す
る。これらの引用規格は,その最新版(追補を含む。)を適用する。
    JIS K 3703-1 コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定方法−第1部 : ベア
        ード・パーカー寒天培地
    JIS K 8008 生化学試薬通則
    ISO 6887-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs−Preparation of test samples,of initial
        suspension and decimal dilutions for microbiological examination−Part 1: General rules for the
                                          decimal dilutions
        preparation of the initial suspension and
    ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs−General rules for microbiological examinations

3. 定義

 この規格で用いる主な用語の定義は,次による。
3.1   コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(coagulase-positive staphylococci) この規格の試験によって,寒天培
地上に定形及び/又は非定形コロニーを形成し,コアグラーゼ陽性反応を示す細菌。
3.2   コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の菌数測定方法(enumeration of the coagulase-positive staphylococci)
この規格の試験によって得られる製品1 ml又は1 g当たりのコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の数の測定方法。
3.3   精製水 JIS K 8008の3.2に規定するA2の水。
    備考 これを超す精製度のものを使用することに関しては制限しない。
            なお,滅菌水は,イオン交換水の品質以上のものをオートクレーブ滅菌又はフイルターでろ
          過し滅菌したものとする。また,市販の精製水を用いる場合は,この規定の精製水と同等以上
          の品質のものとする。
4. 一般原則
4.1   ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地に,製品が液体の場合は規定量の製品を,液体以外の製
品の場合は規定量の試料懸濁液を接種した寒天平板培地を作る。
  さらに,試料の10倍段階希釈試料液を接種し,各希釈段階につき2枚ずつ寒天平板培地を作る。
4.2   35 ℃又は37 ℃(1)で各寒天平板培地を1824時間培養する。必要であれば更に24時間培養する。
    注(1) この温度は,関係者で合意を得るものとし,試験報告書に記載する。
4.3   各寒天平板培地当たりの定形コロニー数から,製品1 ml又は1g当たりのコアグラーゼ陽性ブドウ球
菌数を算出する。

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5. 希釈液及び寒天培地
5.1   一般的な試験指針 一般的な試験指針はISO 7218による。
5.2   希釈液 ISO 6887-1及び試験対象の製品を規定する規格による。
5.3   ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地 [参考文献3)及び4)]
    備考 市販の培地を用いてもよい。ただし,製造ロットのばらつきを考慮して,ウシフィブリノーゲ
          ン及びウサギ血しょう溶液の各ロットを陽性対照及び陰性対照を用いて使用前に試験すること
          が望ましい。
5.3.1  基礎培地 JIS K 3703-1の5.3.1に示すとおりに基礎寒天培地を調製する。ただし,分注量は,フ
ラスコ又は瓶1個当たり90 mlとする。
5.3.2  溶液
5.3.2.1  亜テルル酸カリウム溶液 JIS K 3703-1の5.3.2.1に示すとおりに亜テルル酸カリウム溶液を調製
する。
5.3.2.2  ウシフィブリノーゲン溶液
5.3.2.2.1 組成
                              表 1 ウシフィブリノーゲン溶液の組成
              ウシフィブリノーゲン                                    57 g(2)
              滅菌精製水                                               100 ml
                 注(2) ウシフィブリノーゲンの純度による。
           備考 代替物はない。BSE(牛海綿状脳症)が否定されたものを用いる。
5.3.2.2.2 調製 無菌条件下で,使用直前にウシフィブリノーゲンを滅菌精製水に溶解する。
5.3.2.3  ウサギ血しょう(EDTAコアグラーゼ血しょう)及びトリプシンインヒビター溶液
5.3.2.3.1 組成
                   表 2 ウサギ血しょう及びトリプシンインヒビター溶液の組成
              コアグラーゼ試験用EDTA添加ウサギ血しょう                 30 ml
              トリプシンインヒビター                                   30 mg
5.3.2.3.2 調製 無菌条件下で,使用直前に各成分を滅菌精製水を用いて溶解する。
  ウサギ血しょうを凍結乾燥した場合,滅菌精製水に溶解する必要がある。この場合,凍結乾燥ウサギ血
しょうを滅菌水に溶解し,同溶液にトリプシンインヒビターを溶解する。
5.3.3  最終使用寒天培地
5.3.3.1  組成
                                 表 3 最終使用寒天培地の組成
              基礎寒天培地(5.3.1)                                     90 ml
              亜テルル酸カリウム溶液(5.3.2.1)                          0.25 ml
              ウシフィブリノーゲン溶液(5.3.2.2)                        7.5 ml
              ウサギ血しょう及びトリプシンインヒビター溶液(5.3.2.3)    2.5 ml
5.3.3.2  調製 基礎寒天培地を融解し,ウォーターバス(6.3)中で約48 ℃±1 ℃まで冷却する。
  無菌条件下で,あらかじめウォーターバス(6.3)中で48 ℃±1 ℃に温めておいた3種類の溶液を加え
る。各溶液を加えた後は,できるだけ泡立たないようにかき回してよく混和する。
  血しょうの沈殿を避けるため,最終使用培地は調製後直ちに用いる。
         警告 : 市販のウシフィブリノーゲン及びウサギ血しょう溶液を用いる場合,この溶液及び最終使

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