JIS T 5111:2018 歯科―歯科用ユニット給水管路内バイオフィルム処理の試験方法 | ページ 3

                                                                                              9
                                                                   T 5111 : 2018 (ISO 16954 : 2015)
       試験群
       初回の微生物学的       接種済試験水を用いた       最終微生物学的        結果の分析
       サンプリング及び       バイオフィルム除去の      サンプリング及び
            試験                   処理の実施                試験
           (7.3.2)               (7.3.3)                (7.3.4)          (7.3.5)
                      図2−バイオフィルム除去を評価する試験方法のフロー図
  バイオフィルム除去試験には,少なくとも2台の歯科用ユニット又は模擬歯科用ユニット給水システム
を試験群に含まなければならない。対照群として,歯科用ユニット又は模擬歯科用ユニット給水システム
は不要である。試験群の装置は,7.2の対照群の装置から構成され,7.2完了時に形成されたバイオフィル
ムを含むものでなければならない。
    注記 この試験では,バイオフィルムを形成した試験群を使用し,バイオフィルム除去処理の前後の
          比較評価を実施するため,対照群は不要である。
7.3.2  初回の微生物学的サンプリング及び試験
  全ての歯科用ユニット又は模擬歯科用ユニット給水システムの微生物学的サンプリング及び試験は,8.1
によって,バイオフィルム除去の処理を実施直前に実施しなければならない。微生物学的試験のためのサ
ンプルを収集するときには,試験装置の全ての水管路を浄化するための十分な量の滅菌済試験水(接種な
し)を試験装置に供給し,サンプリングの前に5分間,水管路内で滞留させなければならない。
  バイオフィルム除去の処理方法の実施直前に,全ての歯科用ユニット又は模擬歯科用ユニット給水シス
テムの給水チューブの一部をサンプルとして収集し,8.2によってバイオフィルムの特徴付けを実施しな
ければならない。
7.3.3  バイオフィルム除去の処理方法の実施
  形成したバイオフィルムの除去の処理方法は,歯科用ユニット又は水管路処置製品の製造業者の指示に
よって実施し,処理方法の準備,実施において水が必要な場合は,接種済試験水を使用しなければならな
い。
7.3.4  最終微生物学的サンプリング及び試験
  処理方法の有効性を判断するためには,全ての歯科用ユニット又は模擬歯科用ユニット給水システムの
微生物学的サンプリング及び試験を,8.1及び8.2によって,バイオフィルム除去の処理方法の実施後に実
施しなければならない。8.1によって総生菌数カウントのためのサンプルを収集するときには,試験装置
の全ての水管路を浄化するための十分な滅菌済試験水(接種なし)を試験装置に供給し,サンプリング前
に5分間,水管路内で滞留させなければならない。
  バイオフィルム除去の処理方法を実施後,全ての歯科用ユニット又は模擬歯科用ユニット給水システム
の給水チューブの一部をサンプルとして収集し,8.2によってバイオフィルムの特徴付けを実施しなけれ
ばならない。
  8.1及び8.2によって,処理を実施した後のサンプル収集の最も適切な時間に関する考察を実施しなけれ
ばならない。処置水又は別の溶液によるフラッシングが製造業者によって指示されている場合は,サンプ
リング及び試験の前にフラッシングを実施しなければならない。
7.3.5  結果の分析
  バイオフィルム除去の処理方法の有効性は,次の項目を報告し,特徴付けを実施しなければならない。
− 8.1に従った,バイオフィルム除去の処理方法の実施前後の試験群及び対照群における処置水中の総生

――――― [JIS T 5111 pdf 11] ―――――

10
T 5111 : 2018 (ISO 16954 : 2015)
    菌数カウントの対数値(平均,標準偏差及び反復数)
− 処置水中の総生菌数カウントの対数値の低下(すなわち,処理の実施前後の平均値の相違)
− 処理方法の実施前後で試験群及び対照群の総生菌数カウントの結果を対数変換し,有意確率P<0.05
    を使用した両側検定の統計分析を実施して比較した結果
− 8.2に従ったバイオフィルム除去の処理方法の前後でサンプル収集した各水管路のバイオフィルム被
    覆率の比較

8 微生物学的サンプリング及び試験

8.1 処置水の細菌レベルの計数

8.1.1  サンプリング
8.1.1.1  一般
  サンプリングは,ISO 19458のガイダンスによる。計量は,サンプル収集後24時間以内に開始し,収集
したサンプルは,カウントがサンプリング時間から30分以内に開始できない場合,(4±2)℃環境下で保
管しなければならない。
  全ての試験サンプルは,残留抗菌薬を含む場合,それを不活性化させるために速やかに処理しなければ
ならない。可能な方法として,中和剤の投与又は試験サンプルを0.2 μmの膜でろ過した後に,滅菌済りん
酸緩衝生理食塩水で洗浄する方法などがある。中和剤を使用する場合,その有効性及び菌との適合性を中
和試験で確認し,対照群及び試験群のサンプルは,同じように取り扱わなければならない。
8.1.1.2  試験装置に供給する水のサンプリング
  指定したサンプリングの場合,試験装置に供給した接種済試験水の1サンプルに付き50 mL以上収集し,
分析しなければならない。
8.1.1.3  試験装置から排出する水のサンプリング
  指定したサンプリングの場合,一つの複合試料の処置水が,その総量50 mL100 mLとなるよう,異な
った水の出口から,各々がほぼ同量になるように,他の菌の浸入に注意し,各歯科用ユニット又は模擬歯
科用ユニット給水システムから収集しなければならない。各歯科用ユニット又は模擬歯科用ユニット給水
システムの各水出口から個別のサンプルを回収し,個別に分析することができる。
8.1.2  総生菌数カウント試験法
  総生菌数カウントは,平板培養法によって実施しなければならない [12]。
  100(すなわち,未希釈)から10−3(滅菌済りん酸緩衝生理食塩水にて)の10倍連続希釈液の試験サン
プル各3セットを準備しなければならない。結果が特定の範囲に該当すると予想される場合,3セットの
準備では希釈液が少ない場合がある。
  1.0 mL又は0.10 mLの各希釈液をR2A寒天に移し,倒置又は培養前にサンプルが培地に十分吸収するた
めの時間を与えて,(23±3)℃の環境温度で7日間好気的に培養しなければならない。
  培養後は,コロニー数を数え,CFU/mL単位で報告し,各セットサンプルの総生菌数カウントの対数値
(すなわち,総生菌数カウントの常用対数)の平均及び標準偏差を報告しなければならない。
8.1.3  代替総生菌数カウント試験法
  浮遊性細菌レベルは,代替的にメンブレンフィルタ法によってカウント計量することができる [12]。例え
ば,サンプル中の残存抗菌材を不活性化する実用的な方法が知られていない場合又は使用できない場合,
この方法は適切である。
  100(すなわち,未希釈)から少なくとも10−4(滅菌済りん酸緩衝生理食塩水にて)の10倍連続希釈液

――――― [JIS T 5111 pdf 12] ―――――

                                                                                             11
                                                                   T 5111 : 2018 (ISO 16954 : 2015)
の試験サンプル各3セットを準備し,10 mLごとの希釈液の試験を実施しなければならない。結果が特定
の範囲に該当すると予想される場合,3セットの準備では希釈液が少ない場合がある。
  サンプルのメンブレンフィルタ後又は希釈液サンプルは,抗菌材がサンプル内にある場合は,ろ過液と
膜とを10 mL分量の滅菌済りん酸緩衝生理食塩水で2回ろ過して洗浄しなければならない。膜は,気泡が
膜と培地との間に残留しないよう,R2A寒天に移し,(23±2)℃の環境温度で7日間好気的に培養しなけ
ればならない。
  培養後,コロニー数を計量し,CFU/mL単位で報告し,各セットサンプルの総生菌数カウントの対数値
の平均及び標準偏差を報告しなければならない。

8.2 水管路表面のバイオフィルム

8.2.1  サンプリング
  指定されたサンプリングの場合,少なくとも1 cmの水管路チューブのサンプルを,各々の水管路出口近
くで,他の菌が混入しないよう切り取られなければならない。適切な場合,試験装置に残ったチューブは,
滅菌した接続部品を使用して試験が再開できるように再接続しなければならない。
  切断したチューブサンプルは,固定後の脱水前(8.2.2参照)に,縦方向にほぼ均等に二つに切断しなけ
ればならない。サンプルを縦方向に分割する場合,チューブ表面からバイオフィルムのがれを低減する
ため,切断方向はチューブ軸に平行としなければならない。
8.2.2  バイオフィルムの評価の試験手順
  走査電子顕微鏡(SEM)法を使用して,各チューブサンプルの両半分の表面上のバイオフィルム被覆率
を評価し,チューブサンプルの表面上のバイオフィルムのSEM分析において,SEM分析用に適切な方法
で,固定,脱水,乾燥,取付け及び伝導性材料を使用したスパッタコーティングでサンプルを調製しなけ
ればならない。
    例 SEM用サンプルの調製ステップの方法例を,次に示す。
        − 2 %のグルタルアルデヒドを添加した0.1 mol/Lのカコジル酸ナトリウム緩衝溶液中に,チュ
            ーブサンプルを室温で30分から4時間固定し,その後グルタルアルデヒド未添加カコジル酸
            ナトリウム緩衝溶液で3回,洗浄する。
        − エチルアルコールの濃度を30 %,50 %,70 %,90 %,95 %及び100 %へ増加し,各エチルア
            ルコール水溶液でチューブサンプルを10分間,脱水する。
        − チューブサンプルを臨界乾燥する。
        − 両面伝導性テープを使用して,SEMスタブにチューブサンプルを取り付ける。
        − 金パラジウムでチューブサンプルにスパッタコーティングを実施する。
  チューブサンプルの表面上に特定の細菌が存在する場合,SEM装置及び操作パラメータの選択によって,
試験水接種用の細菌を特定するための画像を作成することができるようにしなければならない。
  環境制御型SEM(ESEM)では,分析前に固定,脱水,乾燥,及びスパッタコーティングを実施せずに
使用することができる。
  チューブサンプルは,1 000倍未満でスキャンする。半分に切断された各チューブサンプルを,サンプル
の典型的なバイオフィルム被覆率(未被覆)を示す部位を少なくとも3か所選択し,1 000から5 000倍で
観察する。選択した各部位の代表的な顕微鏡写真を取り込み,記録する。
  各チューブサンプルのバイオフィルム被覆率は,次の分類に従い,定性的に評価しなければならない。
− 微生物又はバイオフィルムが存在しない。
− 微生物及び/又はバイオフィルムが点在する(密集被覆率は,チューブサンプルの全表面の10 %程度

――――― [JIS T 5111 pdf 13] ―――――

12
T 5111 : 2018 (ISO 16954 : 2015)
    よりも低い。)。
− 比較的密集した微生物及び/又はバイオフィルムが存在する(すなわち,密集被覆率は,チューブサ
    ンプルの全表面の50 %程度を下回る。)。
− 相当量密集した微生物及び/又はバイオフィルムが存在する(すなわち,密集被覆率は,チューブサ
    ンプルの全表面の50 %程度を上回る。)。
  各チューブサンプルの最も密集した部位の代表的な画像を,試験報告書に含まなければならない。

9 試験報告書

  試験報告書には,次の事項を含まなければならない。
a) 試験に使用した歯科用ユニット又は模擬歯科用ユニット給水システムの詳細
b) 実施した歯科用ユニット処置水供給システムの処理方法の詳細
c) 試験装置の設計及び操作方法の詳細
d) 特定の試験パラメータを含む,使用した試験方法の詳細
e) 試験に使用した細菌の詳細
f)  試験に使用した微生物学的サンプリング及び試験方法の詳細
g) 試験の結果,分析及び結論
h) 結果又はその妥当性に影響すると考えられる環境又は条件
i)  規定した試験方法に従わなかった事項
j)  この規格,すなわち,JIS T 5111の引用
k) 責任者名及び試験所の名称
l)  試験の実施者及び試験監督者
m) 試験期間の日付
n) 試験監督者の所見
o) 試験報告書の作成日付及び責任者の署名又は押印

――――― [JIS T 5111 pdf 14] ―――――

                                                                                             13
                                                                   T 5111 : 2018 (ISO 16954 : 2015)
                                          参考文献
[1] Ainsworth R. ed. World Health Organization. Safe Piped Water: Managing Microbial Water Quality in Piped
    Distribution Systems. IWA Publishing, 2004
[2] Brenner K.P., & Rankin C.C., New screening test to determine the acceptability of 0.45-micron membrane
    filters for analysis of water. Appl. Environ. Microbiol. 1990, 56 (1)   p. 54-64
[3] Curtin J.J., & Donlan R.M. Using Bacteriophages To Reduce Formation of Catheter-Associated Biofilms by
    Staphylococcus epidermidis. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50 (4)   p. 1268-1275
[4] Hannig C., Follo M., Hellwig E., Al-Ahmad A. Visualization of adherent micro-organisms using different
    techniques. J. Med. Microbiol. 2010, 59 pp. 1-7
[5] Walker J.T., Bradshaw D.J., Bennett A.M., Fulford M.R., Martin M.V., Marsh P.D. Microbial biofilm formation
    and contamination of dental-unit water systems in general dental practice. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66
    (8)   p. 3363-3367
[6] Walker J.T., Bradshaw D.J., Fulford M.R., Marsh P.D. Microbiological evaluation of a range of disinfectant
    products to control mixed-species biofilm contamination in a laboratory model of a dental unit water system.
    Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69 (6)   p. 3327-3332
[7] Official Method A.O.A.C. 960.09, Germicidal and Detergent Sanitizing Action of Disinfectants. AOAC
    International, 2000
[8] ASTM E 1427-00,Standard Guide for Selecting Test Methods to Determine the Effectiveness of Antimicrobial
    Agents and Other Chemicals for the Prevention, Inactivation and Removal of Biofilm
[9] Council Directive 98/83/EC of 3 November 1998 on the quality of water intended for human consumption.
    Official Journal of the European Communities. L330:32-54
[10] DVGW W 270, Microbial Enhancement on Materials to Come into Contact with Drinking Water−Testing and
    Assessment. German Association for Gas and Water Industry Association (DVGW), 2007
[11] ISO 2174,Surface active agents−Preparation of water with known calcium hardness
[12] ISO 8199:2005,Water quality−General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture
[13] JIS T 5912:2015 歯科−ハンドピース及びモータ
      注記 原国際規格では,ISO 14457:2012,Dentistry−Handpieces and motorsを記載している。
[14] ISO 16266,Water quality−Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa−Method by membrane
    filtration
[15] Method 9215 Heterotrophic Plate Count, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,
    American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation, 2004
[16] Method 2340 Hardness (Methods 2340B and 2340C), Standard Methods for the Examination of Water and
    Wastewater. American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment
    Federation, 1997
[17] WHO/HSE/WSH. 10.01/10, Hardness in drinking-water: background document for development of WHO
    guidelines for drinking-water quality. World Health Organization. WHO, 2011