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※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
導入
磁気ビーズは、数十ナノメートルから数百マイクロメートルのサイズ範囲の非磁性マトリックス内に固定化された多数の磁性ナノ粒子で構成されています（付録 A を参照）。固定化マトリックスは通常、シリカまたは有機ポリマーをベースとしています。ビーズは通常、エタノール、イソプロパノール、アジ化ナトリウム溶液、純水などの懸濁液に分散させて供給されます。懸濁液中の磁気ビーズは、その独特の磁気特性と印加磁場との相互作用により、生物学および化学分野で最も広く使用されているナノマテリアルの 1 つとなっています。
磁性物体のサイズが十分に小さい場合、それは単一の磁区を形成し、単一の大きなマクロスピンとして動作します。さらに小さいサイズ (酸化鉄の場合、通常 30nm [ 1] 未満) では、物体の熱エネルギーが物体の磁化方向の頻繁な再配向を引き起こすのに十分な場合があります。これらの再配向のタイムスケールが測定のタイムスケールよりも短い場合、この挙動を説明するために「超常磁性」という用語が使用され、磁性ナノオブジェクトは超常磁性であると言われます。このような粒子の相互作用しない大規模な集団では、熱的に誘発されたスイッチング現象により、磁場が印加されていない場合、集団の平均磁化はゼロになります。印加された大きな磁場の存在下では、磁場が熱変動を克服し、集合内の個々の磁性ナノオブジェクトのマクロスピンが整列するため、磁性ナノオブジェクトの集合体は大きな正味の磁化を獲得することが観察されます。ビーズは、この挙動を示す磁性ナノオブジェクトの大部分を組み込んでいる場合、「超常磁性ビーズ」と呼ばれることがよくあります。ただし、ビーズ自体は超常磁性ではない可能性があるため、「磁性ビーズ」と呼ばれます。
磁気ビーズは多くの分野、特に体外診断、標的薬物送達[ 3] ～ [5] 、磁気共鳴画像法[ 6 ], 生物分離[ 7] 、遺伝子工学[ 8] などのバイオセンシング用途[ 2] に応用] れています。例えば、遺伝情報を運ぶ核酸は、適切に官能化された磁気ビーズを使用して、血液、唾液、糞便、尿、葉、ウイルス溶解物から抽出または単離することができる。
核酸 (DNA) とリボ核酸 (RNA) は、生物がその生体構造を構築または維持するために使用する重要な情報を担っています。 DNA を正確に特定すると、健康に関する非常に貴重な情報が得られます。近年、科学者らはヒトの血流中に循環無細胞 DNA (cfDNA) だけでなく、循環腫瘍 DNA (ctDNA) も発見しました。現在、ctDNA 抽出は、がんの判定やがんの進行の追跡に最も広く使用されているリキッドバイオプシー法の 1 つです。しかし、ctDNAの含有量はcfDNA総量の1%以下にすぎません。 cfDNA の濃度は非常に低く、一般に 5 ng/ml 血液から 30 ng/ml 血液です。したがって、ctDNA を抽出するための信頼できる方法の開発が重要です。 DNA 抽出用磁気ビーズの物理化学的特性を適切に説明することは、抽出キットの開発者にとっても、それを DNA 分析に適用するユーザーにとっても有益です。
磁性ビーズへの核酸の結合は、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、またはビーズ表面への特異的な結合機構に依存します。細胞または組織の溶解物からの DNA または RNA が溶液中に放出されると、核酸は表面修飾された磁気ビーズに結合して「核酸-磁気ビーズ複合体」を形成します。 [ 9]-[19]
次に、磁場と磁場勾配の適切な組み合わせの下で複合体を分離できます。溶出液は残留不純物を洗い流すことができます。最後に、脱塩と精製を経て、ビーズから抽出対象の核酸を得ることができます。 [ 9]-[19]
核酸抽出用の磁気ビーズや分散媒体の形状が異なると、比表面積、ビーズ濃度などの物理化学的特性も異なります。これらすべての特性は、核酸を抽出する性能にさまざまな程度影響を与えます。 [ 9]-[19]
他のナノ構造材料と同様に、複合磁気ビーズの製造と材料仕様は複雑です。ビーズの製造および機能化中の合成条件のわずかな変動により、製造されたビーズの特性および結合能力に劇的な変化が生じる可能性があります。このため、これらの製品には高い製造一貫性が求められます。現在、さまざまなメーカーがさまざまな特性を提供しており、ほとんどのメーカーは測定方法を提供していないため、消費者や規制当局がさまざまな製品を比較したり、特性を検証したりすることが困難であり、アプリケーションのさらなる開発が困難になっています。顧客の信頼と核酸抽出製品の品質を確保するには、磁気ビーズの広く受け入れられている材料仕様と試験報告書が必須です。
Introduction
Magnetic beads are composed of a large number of magnetic nanoparticles immobilized within a nonmagnetic matrix with a size range between tens of nanometres and hundreds of micrometres (see Annex A). The immobilization matrix is typically based on silica or organic polymers. The beads are commonly supplied while dispersed in a liquid suspension, for example, ethanol, isopropanol, sodium azide solutions, pure water. Magnetic beads in liquid suspension have become one of the most widely used nanomaterials in the biological and chemical fields, due to their unique magnetic properties and interactions with applied magnetic fields.
When the size of a magnetic object is small enough, it will form a single magnetic domain, behaving as a single large macrospin. At yet smaller sizes (for iron oxide, typically less than 30nm[1]), the thermal energy of the object can be sufficient to result in frequent reorientations of the magnetization direction of the object. If the timescale of these reorientations is shorter than the timescale of the measurement, the term ‘superparamagnetism’ is used to describe this behaviour and the magnetic nano-objects are said to be superparamagnetic. In large non-interacting ensembles of such particles, the thermally induced switching events will result in the average magnetization of the ensembles being zero in the absence of an applied magnetic field. In the presence of an applied large field, the ensemble of magnetic nano-objects is observed to acquire a large net magnetization, as the magnetic field overcomes the thermal fluctuations and aligns the macrospins of the individual magnetic nano-objects within the ensemble. Beads, if incorporating a large fraction of magnetic nano-objects which exhibit this behaviour, are often referred to as “superparamagnetic beads”. However, as the beads may not themselves be superparamagnetic, they are referred to as “magnetic beads” herein.
Magnetic beads have been applied in many fields, especially in biosensing applications[2] such as in vitro diagnostics, targeted drug delivery[3]-[5], magnetic resonance imaging[6], bioseparation[7], and genetic engineering[8], among others. For example, nucleic acids, which carry genetic information, can be extracted or isolated from blood, saliva, faeces, urine, leaves, viral lysates, using suitably functionalized magnetic beads.
The nucleic acids (DNA) and ribonucleic acid (RNA) carry the key information that organisms use to build or maintain their biostructures. Correctly identifying DNA offers immensely valuable information on health. In recent years, in the human blood stream, scientists have not only found circulating cell free DNA (cfDNA), but also circulating tumour DNA (ctDNA). Now ctDNA extraction is one of the most widely used liquid-biopsy methods to determine cancer or track cancer development. However, the content of ctDNA is only 1 % or less of the total cfDNA amount. The concentration of cfDNA is very low, generally 5 ng/ml blood to 30 ng/ml blood. Therefore, the development of reliable methods for extracting the ctDNA is critical. The proper description of physicochemical characteristics of magnetic beads for DNA extraction is both valuable for developers of extraction kits and for users applying them for DNA analysis.
Nucleic acid binding to magnetic beads relies on electrostatic interactions, hydrophobic interactions, hydrogen bonding or specific binding mechanisms to the bead surface. Once DNA or RNA from cell or tissue lysate is released into the solution, then nucleic acids can bind to surface-modified magnetic beads to form a “nucleic acid-magnetic bead complex”.[9]-[19]
Then, the complex can be separated under a proper combination of magnetic field and magnetic field gradient. The eluate can wash away the residual impurities. Finally, the nucleic acids to be extracted can be obtained from the beads after desalination and purification.[9]-[19]
The different forms of magnetic beads and dispersing media for the extraction of nucleic acid will have different physicochemical characteristics such as specific surface area, bead concentration etc. All these characteristics will affect their performance to extract nucleic acid to varying extents. [9]-[19]
In common with other nanostructured materials, the manufacturing and material specification of composite magnetic beads are complex. Small variations in the synthesis conditions during bead manufacturing and functionalization can lead into dramatic shifts in the properties and binding capacities of the manufactured beads. This requires these products to have high manufacturing consistency. Currently, different manufacturers provide different characteristics and most of them never provide the measurement methods, so it is difficult for consumers or regulators to compare different products or to verify the characteristics, which increases the difficulty of further development of the application. Universally accepted material specification and test reports for magnetic beads are a requirement in order to ensure customer confidence and the quality of the nucleic acid extraction products.