JIS K 3703-3:2008 コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定方法―第3部:低菌数の検出法及び最確数(MPN)法による生菌数測定法 | ページ 2

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K 3703-3 : 2008
る。
JIS K 3702 培地の試験方法−試料懸濁液及び希釈系列の調製方法
備考 ISO 6887-1:1999,Microbiology of food and animal feeding stuffs−Preparation of test samples,
initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination−Part 1: General rules for
the preparation of the initial suspension and decimal dilutionsからの引用事項は,この規格の該当
事項と同等である。
JIS K 3703-1 コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定方法−第1部 : ベア
ード・パーカー寒天培地
備考 ISO 6888-1:1999,Microbiology of food and animal feeding stuffs−Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) −Part 1:
Technique using Baird-Parker agar mediumからの引用事項は,この規格の該当事項と同等であ
る。
JIS K 3703-2 コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定方法−第2部 : ウサ
ギ血しょう(漿)フィブリノーゲン寒天培地
備考 ISO 6888-2:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs−Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)−Part 2:
Technique using rabbit plasma fibrinogen agar mediumからの引用事項は,この規格の該当事項と
同等である。
JIS K 8008 生化学試薬通則
ISO/TS 11133-2:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs−Guidelines on preparation and
production of culture media−Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media

3. 定義

 この規格で用いる主な用語の定義は,JIS K 3701,JIS K 3702,JIS K 3703-1,JIS K 3703-2,
JIS K 8008によるほか,次による。
3.1 コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(coagulase-positive staphylococci) 選択培地上に定形及び/又は非定
形コロニーを形成し,コアグラーゼ反応陽性反応又はウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地上でウサ
ギ血しょうに特異的凝集反応を示す細菌。
備考 この規格では,強いコアグラーゼ陽性反応によって,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の確認を行
っているが,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌にはコアグラーゼ陽性反応が弱い菌株があることが
確認されている。これらの弱陽性の菌株は他の細菌と混同される可能性があるが,耐熱性ヌク
レアーゼ産生性などの追加試験を行うことによって鑑別できる。
3.2 コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の計数(enumeration of coagulase-positive staphylococci) 試料1 ml又
は1 g中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌数は,JIS K 3703-2に規定する方法に従って求める。
3.3 精製水 JIS K 8008の3.2に規定するA2の水。
備考 これを超える精製度のものを使用することに関しては制限しない。滅菌水は,イオン交換水の
品質以上のものを乾熱滅菌若しくは蒸気滅菌又はフィルターでろ過し除菌したものとする。ま
た,市販の精製水を用いる場合は,この規格で規定する精製水と同等以上の品質のものとする。

4. 一般原則

4.1 検出法

――――― [JIS K 3703-3 pdf 6] ―――――

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K 3703-3 : 2008
4.1.1 液体試料であれば規定量の試料を,他の試料であれば規定量の試料懸濁液(JIS K 3702参照)を,
選択培地に接種する。
4.1.2 各試験管を37 ℃で嫌気的に24時間及び48時間培養する。培養後に亜テルル酸カリウムの減少(黒
変又は黒色の沈殿物の生成)が認められる場合,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の存在が推定される。
備考 この規格では,各試験管に寒天又は流動パラフィンを重層して嫌気環境を得る。嫌気状態のジ
ャー又は細菌培養器(6.1)内で試験管を培養する方法もある。
4.1.3 24時間後,ベアード・パーカー選択寒天培地上に陽性と推定される試験管(4.1.2)の培養液を接
種する。残りの試験管については,いずれも48時間後に接種を行う。
4.1.4 試験管(4.2.2)の培養液を接種した各ベアード・パーカー選択寒天培地を37 ℃で24時間及び48
時間培養する。培養後に亜テルル酸カリウムの減少及び卵黄反応が認められる場合,コアグラーゼ陽性ブ
ドウ球菌の存在を推定できる。
4.1.5 定形及び/又は非定形コロニーについて,コアグラーゼ反応陽性を示すコロニーを確認する。
4.1.6 ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地上に試料を接種してもよい。コアグラーゼ陽性のブドウ
球菌の存在は,適切な培養[JIS K 3703-2の9.(実施手順)による。]後に,ウサギ血しょうフィブリノー
ゲンに特異反応を示すコロニーとして確認できる。
4.1.7 結果は,試料x g又はx mL中にコアグラーゼ陽性ブドウ球菌が“陽性”又は“陰性”と記録する。

4.2 生菌数測定法

4.2.1  当該試料の希釈系列(段階希釈試料液)を,液体選択培地に接種する。
4.2.2 各試験管を37 ℃で嫌気的に24時間及び48時間培養する。亜テルル酸カリウムの減少が認められ
る場合,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の存在を推定できる。
備考 この規格では,各試験管に寒天又は流動パラフィンを重層して嫌気環境を得る。嫌気状態のジ
ャー又は細菌培養器(6.1)内で試験管を培養する方法もある。
4.2.3 24時間後,ベアード・パーカー選択寒天培地上に陽性と推定される試験管(4.2.2)の培養液を接
種する。残りの試験管については,いずれも48時間後に接種を行う。
4.2.4 試験管(4.2.2)の培養液を接種した各ベアード・パーカー選択寒天培地を37 ℃で24時間及び48
時間培養する。培養後に亜テルル酸カリウムの減少及び卵黄反応が認められる場合,コアグラーゼ陽性ブ
ドウ球菌の存在を推定できる。
4.2.5 定形及び/又は非定形コロニーについて,コアグラーゼ反応陽性を示すコロニーを確認する。
4.2.6 菌が確認された希釈試料液(4.2.5又は4.1.6)について,試料1 g又は1 mL当たりのコアグラーゼ
陽性ブドウ球菌の最確数(MPN)を,最確数表(JIS K 3701参照)を参照して算出する。

5. 希釈液及び培地

 JIS K 3701による。培地及び試薬の調製に用いる素材は,分析用として品質が保証
されているものを使用する。

5.1 希釈液

 JIS K 3702による。

5.2 改変Giolitti-Cantoniブロス(ブイヨン又は液体培地)

5.2.1  基礎培地
5.2.1.1 組成 組成は,表1による。

――――― [JIS K 3703-3 pdf 7] ―――――

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K 3703-3 : 2008
表1 基礎培地の組成
2倍濃度培地 1倍濃度培地
カゼインの酵素分解物 20.0 g 10.0 g
肉エキス 10.0 g 5.0 g
酵母エキス 10.0 g 5.0 g
塩化リチウム 10.0 g 5.0 g
マンニトール 40.0 g 20.0 g
塩化ナトリウム 10.0 g 5.0 g
グリシン 2.4 g 1.2 g
ピルビン酸ナトリウム 6.0 g 3.0 g
ポリオキシエチレンソルビタン
2.0 g 1.0 g
モノオレエート(Tween 80)
精製水 1 000 mL 1 000 mL
5.2.1.2 調製 各成分を精製水に溶解する。必要に応じて加温・かくはんし,完全に溶解する。室温まで
冷却し,必要であれば滅菌後の最終pHが6.9±0.2となるようにpHを調整する。適切な大きさの試験管
(例 : 1倍濃度培地の場合 16 mm×160 mm,2倍濃度培地の場合 20 mm×200 mm)に,培地を適当量分
注する。オートクレーブで121 ℃,15分間滅菌する。
5.2.2 亜テルル酸カリウム溶液
5.2.2.1 組成 組成は,表2による。
表2 亜テルル酸カリウム溶液の組成
亜テルル酸カリウム(K2TeO3) 1.0 g
精製水 100 mL
5.2.2.2 調製 最小限の加熱で亜テルル酸カリウムを精製水に溶解する。白色の不溶物が精製水中に生じ
た場合は,これを用いない。孔径0.22 ンブランフィルターを用いてろ過し,除菌する。溶液は3
±2 ℃で最長1か月間保存できる。白色の沈殿物が生じた場合は,溶液を用いない。
5.2.3 完全培地 使用直前に,基礎培地(5.2.1)を100 ℃で15分間加熱し,空気を追い出す。4447 ℃
まで冷却し,1倍濃度培地の場合は試験管1本につき0.1 mL,2倍濃度培地の場合は試験管1本につき0.2
mLの亜テルル酸カリウム溶液(5.2.2)を無菌操作で加える。
5.2.4 培地の品質保証のための性能 改変Giolitti-Cantoniブロス(ブイヨン又は液体培地)の性能基準を,
表3に示す。

――――― [JIS K 3703-3 pdf 8] ―――――

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K 3703-3 : 2008
表3 改変Giolitti-Cantoniブロス(ブイヨン又は液体培地)の性能基準
品質管
機能 培養 品質管理用菌株 対照培地 基準
理方法
黄色ブドウ球菌ATCC
6538 P若しくは25923
選択培地
+競合菌株(大腸菌
上のコロ
37 ℃, (E. coli)ATCC 8739 半定量
培養能 ニー数が
48時間 若しくは25922),又は 法
10個を超
他の菌株保存機関に
える。
登録されている同じ
菌株
大腸菌ATCC 25922若 TSA 選択培地
37 ℃, (トリプト
しくは8739,又は菌株 半定量 上では,
選択性
48時間 保存機関に登録され ソイ寒天 法 発育しな
ている同じ菌株 培地) い。
備考 選択性(selectivity)及び培養能(productivity)の定義については,ISO/TS
11133-2による。これらの菌株は理化学研究所生物基盤研究部微生物系
統保存施設,独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門など
から購入可能である。

5.3 寒天溶液

5.3.1  組成 組成は,表4による。
表4 寒天溶液の組成
寒天 1520 g
精製水 1 000 mL
備考 寒天の量は,寒天のゲル強度による。
5.3.2 調製 寒天を精製水に懸濁した後,121 ℃で15分間オートクレーブにかける。使用前に4447 ℃
まで冷却し,適切な容量の試験管に分注する。保存は,JIS K 3701に準拠する。

5.4 ベアード・パーカー選択寒天培地

5.4.1  組成及び調製 JIS K 3703-1による。
5.4.2 培地の性能 ベアード・パーカー選択寒天培地の性能基準を,表5に示す。
表5 ベアード・パーカー選択寒天培地の性能基準
対照 品質管 基準及びコロ
機能 培養 品質管理用菌株
培地 理方法 ニーの特徴
PR≧0.5。
黄色ブドウ球菌
黒色又は灰色
37 ℃, ATCC 6538若しくは
のコロニーで
培養能 2448 25923,又は他の菌株 TSA 定量法
透明なハロー
時間 保存機関に登録され
(卵黄反応)
ている同じ菌株
をもつ。
大腸菌ATCC 25922若
生育が完全に
37 ℃, しくは8739,又は菌
選択性 − 定量法 阻害されるこ
48時間 株保存機関に登録さ
と。
れている同じ菌株

――――― [JIS K 3703-3 pdf 9] ―――――

6
K 3703-3 : 2008
表5 ベアード・パーカー選択寒天培地の性能基準(続き)
表皮ブドウ球菌 黒色又は灰色
(S. epidermidis) のコロニーで
37 ℃,
ATCC 12228,又は他 透明なハロー
特異性 2448 − 定量法
の菌株保存機関に登 (卵黄反応)
時間
録されている同じ菌 をもたないも
株 の。
備考 これらの菌株は理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設,独立
行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門などから購入可能で
ある。
PR(培養能指標)は,次の式によって算出する。
NS
PR
No
ここに, Ns : 1枚又はそれ以上の試験培地のシャーレに出現したコロニ
ーの総数
No : 1枚又はそれ以上の対照培地のシャーレに出現したコロニ
ーの総数

5.5 ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地

 [参考文献(6)及び(7)参照]
5.5.1 組成及び調製 JIS K 3703-1による。
5.5.2 培地の性能 ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地の性能基準を,表6に示す。
表6 ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地の性能基準
対照 品質管 基準及びコロ
機能 培養 品質管理用菌株
培地 理方法 ニーの特徴
黄色ブドウ球菌(S.
PR≧0.5。
aureus)ATCC 6538若
37 ℃, 黒色又は灰色
しくは6538P,25923,
培養能 2448 TSA 定量法 のコロニーで
又は他の菌株保存機
時間 混濁したハロ
関に登録されている
ーをもつ。
同じ菌株
大腸菌(E. coli)ATCC
25922若しくは8739,
選択性 37 ℃, 生育が完全に
又は菌株保存機関に − 定量法
48時間 阻害される。
登録されている同じ
菌株
表皮ブドウ球菌
(S. epidermidis) 黒色又は灰色
37 ℃,
ATCC 12228,又は他 のコロニーで
特異性 2448 − 定量法
の菌株保存機関に登 混濁したハロ
時間
録されている同じ菌 ーをもつ。

備考 これらの菌株は理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設,独
立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門などから購入可能
である。

5.6 ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス(ブイヨン又は液体培地)

5.6.1  組成及び調製 JIS K 3703-1による。

――――― [JIS K 3703-3 pdf 10] ―――――

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  • ISO 6888-3:2003(MOD)

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