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※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
序章
等温核酸増幅は、一定温度のポリメラーゼ触媒反応を使用して核酸標的配列を増幅する方法を説明しています[1][2][3][4][5][6] 。サーマル サイクラー ベースのポリメラーゼ連鎖反応とは対照的に、等温核酸増幅では、変性、アニーリング、および重合のための可変温度サイクリングは必要ありませんが、場合によっては、プライマーの結合には 1 回の高温変性とアニーリング ステップが必要です。等温増幅法は、「等温PCR（isoPCR）」という用語で説明できます。
当然のことながら、生物は細胞分裂中に DNA を等温的に複製し、RNA を転写して構造成分と調節成分を生成します。 IsoPCR は、天然および合成の両方の等温酵素プロセスを活用します。酵素には、DNA および RNA ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびニッカーゼが含まれます。 isoPCR は、変性、重合、およびアニーリングのための可変温度サイクリングを必要としないため、精密なサーマル サイクリング装置は必要ありません。反応は、ニッカーゼまたは置換酵素が反応中に存在せず、最初の変性が必要な場合を除いて、単一の温度で実行されます。さらに、さまざまな非酵素的核酸結合タンパク質が必要になる場合があります。多くのアプリケーションでの IsoPCR 増幅は、核酸抽出なしで細胞ライセートに対して実行できます。増幅戦略の例としては、ループ媒介等温増幅 (LAMP) [7] 、ローリング サークル増幅 (RCA) [8] 、ヘリカーゼ依存増幅 (HDA) [9] 、リコンビナーゼ ポリメラーゼ増幅 (RPA) [10] 、鎖置換があります。増幅 (SDA) [11] 、核酸配列ベースの増幅 (NASBA) [12] 、および Cas9 ニッカーゼベースの増幅反応 (Cas9nAR) [13] 。 LAMP, RCA, HDA, RPA, SDA, および NASBA 戦略は、増幅された核酸にデオキシリボ核酸 (DNA) とリボ核酸 (RNA) の両方を組み込むことができます。 Cas9nAR は、増幅の開始テンプレートとして DNA のみを使用できます。
IsoPCR 法は、食品および食品中の特定の低濃度核酸の増幅、検出、同定、定量化、および分析に使用できます。これらの方法は、ほとんどの場合、未精製のヌクレオチド抽出物から核酸を増幅することができます。ターゲット シーケンスの検出は、いくつかの異なる増幅戦略と検出化学の 1 つを使用して、リアルタイムまたはエンドポイント技術によって実現されます。検出化学には、濁度測定、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および蛍光が含まれ、一部のアプリケーションでは、閉じたラテラル フロー デバイス システムで達成できます。
isoPCR 法の主な特徴は、一定温度での核酸増幅、粗抽出物の使用、シンプルな検出方法、精密なサーマル サイクリング装置を必要としない短い反応時間です。
isoPCR メソッドの人気と適用性が高まっているため、食品におけるこれらのメソッドの許容基準を標準化することが重要です。
Introduction
Isothermal nucleic acid amplification describes methods that use constant temperature polymerase-catalysed reactions to amplify a nucleic acid target sequence[1][2][3][4][5][6]. In contrast to thermal-cycler based polymerase chain reactions, isothermal nucleic acid amplification does not require variable temperature cycling for denaturation, annealing, and polymerization although, in some cases, primer binding requires a single high temperature denaturation and an annealing step. Isothermal amplification methods can be described by the term “isothermal PCR (isoPCR)”.
Naturally, living organisms isothermally replicate DNA during cell division and transcribe RNA to produce structural, and regulatory components. IsoPCR leverages both natural and synthetic isothermal enzymatic processes. The enzymes include DNA and RNA polymerase, helicase, recombinase, exonuclease and nickase. Because isoPCR does not require variable temperature cycling for denaturation, polymerization and annealing there is no need for precision thermal cycling instruments. Reactions are run at a single temperature, except in cases where a nickase or displacing enzyme is not present in the reaction and an initial denaturation is required. In addition, various non-enzymatic nucleic acid binding proteins can be necessary. IsoPCR amplification in many applications can be performed on cell lysates without nucleic acid extraction. Some examples of amplification strategies are loop-mediated isothermal amplification (LAMP)[7], rolling circle amplification (RCA)[8], helicase dependent amplification (HDA)[9], recombinase polymerase amplification (RPA)[10], strand displacement amplification (SDA)[11], nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)[12] and Cas9 nickase-based amplification reaction (Cas9nAR)[13]. The LAMP, RCA, HDA, RPA, SDA and NASBA strategies can incorporate both deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) into amplified nucleic acids. Cas9nAR can only use DNA as the starting template for amplification.
IsoPCR methods can be used for amplification, detection, identification, quantification, and analysis of specific low concentration nucleic acids in food and food products. These methods can, in most cases, amplify nucleic acids from un-purified nucleotide extracts. Detection of the target sequence is achieved through real-time or end-point techniques using one of several different amplification strategies and detection chemistries. Detection chemistries include turbidimetry, chromatography, gel electrophoresis and fluorescence, and can, in some applications, be achieved in a closed lateral flow device system.
Key features of isoPCR methods are constant temperature nucleic acid amplification, use of crude extracts, simple detection methods, and short reaction times without the need for precision thermal cycling instruments.
Because isoPCR methods are gaining in popularity and applicability, standardization of the acceptance criteria for these methods in food products is important.