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※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
導入
亜麻仁 ( Linum usitatissimum L.) FP967 (CDC Triffid Flax) は、国際農業バイオテクノロジー出願取得局 (ISAAA) にリストされている唯一の GMO 亜麻仁亜麻です[ 1] 。 FP967は、カナマイシン耐性をコードするNPT-11遺伝子と、クロロスルフロンに対する酵素親和性が低下した修飾シロイヌナズナのアセトレートシンターゼ遺伝子を含むアグロバクテリウム/Tiプラスミドシステムで形質転換された単一のノーリン亜麻胚軸（再生番号12115）から再生されました[ 2][3 [4][5][6][7] 。植物内T-DNA 構築物には、右境界の逆方向反復構造を形成する T-DNA の反復と再配置が含まれており、これは次世代シークエンシングと PCR クローニングによって確認されています。 FP967 GM 構築物は組換え植物ゲノム内で安定しており、スルホニル尿素系除草剤であるクロルスフロン、メツルフロン、およびトリアスルフロンに対して機能的耐性を示します[ 8] 。
FP967 のイベント特異的アッセイが公開されています[ 8][9] 。組換え体から 2 つの製品が生成され、非組換え体から 1 つの製品が生成されます[ 8] 。もう 1 つは単一の産物を生成しますが、亜麻仁特異的 ( Linum usitatissimum ) ステアロイル アシル キャリア タンパク質 デサチュラーゼ 2 遺伝子 (SAD) の内部対照 PCR 検査が必要です[ 9] 。イベント特異的アッセイは、導入遺伝子の正確な同定またはコピー数が必要な場合に、独自の用途や育種用途に最も役立ちます。
この文書に記載されている FP967 PCR アッセイはコンストラクト特異的です[ 10] 。導入遺伝子コンストラクトの T-nos エレメントと dfrA1 エレメントの間の接合部にまたがる 105 bp の産物が生成されます。構築物特異的アッセイは通常、同じ遺伝子融合を伴う異なる GM イベントを交差検出できる汎用 GM スクリーニング ツールとして使用されます。 FP967 はスペクチノマイシン選択マーカーを保持する唯一の亜麻仁構築物であり、リストに掲載されている唯一の GM 亜麻イベントであるため、記載されたアッセイは、承認された GMO 間の遺伝子組み換え同定にとって決定的です。この手法は広く受け入れられ、導入されており、無関係な育種系統や商用ストックからの望ましくない外来性の存在を効果的に特定して排除してきました。また、組換え体には標的のコピーが 2 つ存在するため、利用可能なイベント特異的検査で報告されているものよりも感度が高くなります (図 1 を参照)イベント固有のテスト オプションをテスト ポートフォリオに追加するには、多大な労力 (特に、利用可能なイベント アッセイ固有の 1 つを推奨する実験の比較と検証) が必要になりますが、最終目的には何のメリットもありません。
FP967 の T-DNA の次世代配列決定と PCR クローニングにより、亜麻ゲノムの T-DNA の右端の逆方向反復構造を形成する内部 T-DNA 断片の反復と再配列が明らかになりました。 FP967 T-DNA のコピーは 1 つだけですが、NOS 遺伝子の順序と配置、シロイヌナズナアセト乳酸シンターゼ (NP_001189794.1)、pBR32, ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ I, および大腸菌スペクチノマイシン耐性/ジヒドロ葉酸還元酵素(SpecR/DHFR) 領域は、FP967 の形質転換に使用された元のプラスミドともはや一致しません[ 8] 。この再構成は、構築物特異的アッセイの開発では予想されませんでした。図 1 は、インサートのゲノム位置、予想される組換え構造、および DNA 配列決定に基づいて推定される組換え構造を示すグラフです。また、イベントの場所と、これらのそれぞれについてのコンストラクト固有の PCR アッセイも示します。
図 1 —亜麻ゲノムへの FP967 の挿入
Key
| A | 亜麻ゲノムの挿入部位 | 5 | pBR322 | 12 | FP967挿入部位 |
| B | 予想される組換えT-DNA | 6 | ホモロジー内に残された | a | 非組換え PC |
| C | 推定された組換えT-DNA | 7 | ノパリンシンターゼ | b | 左側イベント特異的 PC |
| 1 | 亜麻仁ゲノム領域 1 | 8 | スペクチノマイシン耐性遺伝子 | c | 右側のイベント固有の PC |
| 2 | 右枠 | 9 | キメラネオマイシンホスホトランスフェラーゼ | d | 特異的な PCR を構築します。 |
| 3 | 未決定の順序 | 10 | シロイヌナズナのアセト乳酸シンターゼ | ||
| 4 | 左枠 | 11 | 亜麻仁ゲノム領域 2 |
注組換え体における T-DNA の再構成の結果として、標的アンプリコンの 2 つのコピーが形成されました。これにより、構築物特異的アッセイの感度が向上します。
Introduction
Flaxseed (Linum usitatissimum L.) FP967 (CDC Triffid Flax) is the only GMO linseed flax listed in the International Service for the Acquisition of Agro-biotech Applications (ISAAA)[1]. FP967 was regenerated from a single Norlin Flax hypocotyl (regenerant number 12115) transformed with an agrobacterium/Ti plasmid system containing the NPT-11 gene encoding kanamycin resistance and a modified Arabidopsis acetolate synthase gene with reduced enzyme affinity for chlorosulfuron[2][3][4][5][6][7]. The in planta T-DNA construct includes a repeat and re-arrangement of the T-DNA forming an inverted-repeat structure of the right border, as confirmed by next generation sequencing and PCR cloning. The FP967 GM construct is stable within the recombinant plant genome and demonstrates functional resistance to the sufonylurea herbicides chlorsufuron, metsulfuron, and triasulfuron[8].
Published event-specific assays for FP967 have been described[8][9]. One generates two products from the recombinant and one product from the non-recombinant[8]. The other generates a single product but requires an internal control PCR test for linseed-specific (Linum usitatissimum) stearoyl-acyl carrier protein desaturase 2 gene (SAD)[9]. Event-specific assays are most useful for proprietary and breeding uses when exact identity or copy number of a transgene is required.
The FP967 PCR assay described in this document is construct-specific[10]. It generates a 105 bp product spanning the junction between the T-nos and dfrA1 elements of the transgene construct. Construct-specific assays are usually used as generic GM screening tools able to cross-detect different GM events carrying the same gene fusion. Because FP967 is the only flaxseed construct to carry a spectinomycin selectable marker and the only listed GM flax event, the described assay is conclusive for genetically modified identification among approved GMOs. It has been widely accepted and deployed and has been effective identifying and eliminating unwanted adventitious presence from unrelated breeding lines and commercial stocks. It is also more sensitive than reported for the available event-specific test because there are two copies of the target in the recombinant (see Figure 1). Adding event-specific testing options to the testing portfolio would require considerable effort (especially experimental comparison and validation to recommend one of the available event-specific assays) with no ultimate benefit to the final purpose.
Next generation sequencing and PCR cloning of the T-DNA of FP967 revealed a repeat and rearrangement of an internal T-DNA fragment forming an inverted-repeat structure of the right border of the T-DNA in the flax genome. Although, there is only a single copy of the FP967 T-DNA, the order and arrangement of the NOS gene, the Arabidopsis acetolactate synthase (NP_001189794.1), pBR322 (J01749.1), neomycin phosphotransferase II (AY909580.1), and the Escherichia coli spectinomycin resistance/dihydrofolate reductase (SpecR/DHFR) region are no longer consistent with the original plasmids used to transform FP967[8]. This rearrangement was not anticipated in the development of the construct specific assay. Figure 1 provides a graphic depicting the genomic position of the insert, the anticipated recombinant structure and the deduced recombinant structure based on DNA sequencing. It also shows the location of the event and construct-specific PCR assays on each of these.
Figure 1 — FP967 insertion into the flax genome
Key
| A | insertion site of flax genome | 5 | pBR322 | 12 | FP 967 insertion site |
| B | anticipated recombinant T-DNA | 6 | left inside homology | a | Non-recombinant PCR. |
| C | deduced recombinant T-DNA | 7 | nopaline synthase | b | Left side event specific PCR. |
| 1 | flaxseed genomic region 1 | 8 | spectinomycin resistance gene | c | Right side event specific PCR. |
| 2 | right border | 9 | chimeric neomycin phosphotransferase | d | Construct specific PCR. |
| 3 | undetermined sequence | 10 | Arabidopsis acetolactate synthase | ||
| 4 | left border | 11 | flaxseed genomic region 2 |
NOTE As a result of the rearrangement of the T-DNA in the recombinant two copies of the target amplicon were formed. This increases the sensitivity of the construct specific assay.