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※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
導入
魚のアッセイは、水生環境における化学物質の毒性を評価するための重要で広く使用されているツールです。しかし、魚を含む脊椎動物を化学試験に使用することには動物福祉上の懸念があります。成魚や稚魚の代わりに初期の生活段階の胚を使用することは、代替アッセイ法と考えられています。なぜなら、例えば OECD TG を使用して、より発達した稚魚をテストすることによって引き起こされる明らかな苦痛の代替として魚の胚をテストすることには、動物福祉上の利点があるからです。 203.
ナノテクノロジーは多くの商業分野にプラスの影響を与えていますが、ナノ対応製品による潜在的な環境への悪影響に関する懸念は依然として残っています。急性毒性の評価に魚類の胚を使用する OECD テスト ガイドライン (OECD TG 236 を参照) では、分子量 3 kDa 以上の一部の物質、非常にかさ高い分子構造、および孵化遅延を引き起こす物質は、その方法を使用したテストには不適切である可能性があると述べられています。絨毛膜の存在は、ナノマテリアルの生物活性の評価を混乱させる可能性もあります。絨毛膜は魚の胚の最も外側の無細胞エンベロープであり、一部の化学物質やナノマテリアルに対する暴露バリアとして機能します。現在、どのナノマテリアルが絨毛膜によってブロックされる可能性があるかを予測することは不可能です。毒性評価に脱絨毛処理された胚を使用することは、直接的な生態毒性学的情報を提供しない可能性がありますが、潜在的に危険なナノマテリアルをより適切に特定するのに役立つ可能性があります。したがって、世界中の多くの研究者が、ゼブラフィッシュの初期段階の胚から絨毛膜を除去するための多くの方法を開発しました[ 1][2] 。胚から絨毛膜を除去するには、酵素的方法と機械的方法の 2 つの方法があります。酵素的脱絨毛処理法には、機械的脱絨毛処理法 (付録 A を参照) に比べて、脱絨毛処理の準備が容易であることによる時間と労働の効率性、機械的胚への損傷がないこと、ハイスループットで多数の脱絨毛処理胚を同時に調製できることなど、いくつかの利点があります。ベースのアプローチ。一方で、プロナーゼ活性が変動するという欠点があり、これが絨毛膜除去の成功率に影響を与える可能性があります。多くのグループが、化学的およびナノマテリアルの毒性を評価するために脱絨毛処理された胚を使用している[ 3][4][5][6] 。ただし、これらの方法はまだ完全に標準化されていません[ 7][8][9][10] 。
脱絨毛ゼブラフィッシュ胚の毒性アッセイは、他の脊椎動物系にとって潜在的に危険なナノマテリアルを検出するための代替システムとして機能します。毒性試験における高等生物動物モデルの使用が改良されているため、代替試験方法の必要性が高まっています。初期生活段階のゼブラフィッシュ (独立採食まで、例えば 120 HPF) は、in vivo 毒性の優れた代替モデルとなる可能性があります[ 22][23][24][25][26][27] 。他の動物モデルと比較して、ゼブラフィッシュは、飼育と繁殖が比較的容易であること、高い繁殖力（体外受精、雌から200～300個の胚）、世代期間が短い（成体になるまで約3か月）など、毒性を評価する上で多くの利点があります。 ）、ゲノムリソースの入手可能性（完全なゼブラフィッシュゲノム配列）、およびヒトとの遺伝的類似性。ヒトの病気の約 70% には少なくとも 1 つのゼブラフィッシュ オーソログがあり、病気に関連するヒト遺伝子の 84% にはゼブラフィッシュのオーソログがあります[ 11] 。したがって、化学毒性を評価するためのゼブラフィッシュの使用が増加しています。
この文書では、絨毛膜を除去するための最適化された手順と、脱絨毛処理されたゼブラフィッシュ胚を使用して毒性アッセイを実施する方法に関する推奨事項を提供します。また、脱絨毛処理された胚を使用した魚毒性アッセイの利点についても説明します。
Introduction
Fish assays are important and widely used tools for evaluating the toxicity of chemicals in the aquatic environment. However, there are animal welfare concerns regarding the use of vertebrate animals for chemical testing, including fish. The use of early life stage embryos, instead of adult or juvenile fish, is considered an alternative assay because there are animal welfare benefits to testing fish embryos as an alternative to the clear distress caused by testing more developed juvenile fish, e.g. by using OECD TG 203.
Nanotechnology is positively affecting many commercial sectors, but there remain concerns regarding the potential adverse environmental effects from nano-enabled products. The OECD test guideline using fish embryos to evaluate acute toxicity (see OECD TG 236) states that some substances having a molecular weight ≥ 3 kDa, a very bulky molecular structure, and substances causing delayed hatching might be inappropriate for testing using that method. The presence of the chorion could also confound assessment of the nanomaterials biological activity. The chorion is the outmost acellular envelope of a fish embryo and it can serve as an exposure barrier for some chemicals or nanomaterials. It is currently not possible to predict which nanomaterials might be blocked by the chorion. Using dechorionated embryos for toxicity assessments may not provide direct ecotoxicological information, but may help to better identify potentially hazardous nanomaterials. Accordingly, many researchers around the world have developed a number of methods for removing a chorion from early life stage zebrafish embryos[1][2]. There are two ways to remove chorion from embryos: by enzymatic or mechanical method. The enzymatic dechorionation method has some advantages over the mechanical dechorionation method (see Annex A), including time and labour efficiency by easy preparation for dechorionation, no mechanical embryonic damage, and the ability to simultaneously prepare a large number of dechorionated embryos for a high throughput-based approaches. On the other hand, there is a disadvantage of variability in pronase activity that could influence the success rate of chorion removal. Numerous groups have used dechorionated embryos for the assessment of chemical and nanomaterial toxicity[3][4][5][6]. However, these methods have not yet been fully standardized[7][8][9][10].
Dechorionated zebrafish embryos toxicity assay can serve as a surrogate system to detect potentially hazardous nanomaterials for other vertebrate systems. As the use of higher organism animal models for toxicity testing is being refined, there is an increasing need for alternative test methods. Early life stage zebrafish (up to independent feeding, e.g. 120 HPF) could be an excellent alternative model of in vivo toxicity[22][23][24][25][26][27]. Compared with other animal models, zebrafish have a number of advantages for assessing toxicity, including the relative ease of rearing and breeding, high fecundity (external fertilization, 200 embryos to 300 embryos from a female), short generation time (approximately 3 months to adulthood), availability of genomic resources (complete zebrafish genome sequence), and genetic similarity to humans. About 70 % of human diseases have at least one zebrafish orthologue and 84 % of the human genes associated with disease have orthologues in zebrafish[11]. Therefore, the use of zebrafish to assess chemical toxicity is increasing.
This document provides an optimized procedure to remove chorions along with recommendations on how to conduct toxicity assays using dechorionated zebrafish embryos. It also discusses the advantages of the fish toxicity assay using dechorionated embryos.