JIS K 0400-80-10:2000 水質―生化学的パラメータの測定―クロロフィルａ濃度の吸光光度定量

K 0400-80-10 : 2000

まえがき

  この規格は,工業標準化法に基づいて,日本工業標準調査会の審議を経て,通商産業大臣が制定した日
本工業規格である。
  制定に当たっては,日本工業規格(日本産業規格)と国際規格との対比,国際規格に一致した日本工業規格(日本産業規格)の作成及び日
本工業規格を基礎にした国際規格原案の提案を容易にするために,ISO 10260 : 1992 (Water quality−
Measurement of biochemical parameters−Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration) を基礎
として用いた。
  JIS K 0400-80-10には,次の附属書がある。
    附属書A(参考) 底生植物濃度の定量
    附属書B(参考) 文献
    附属書1(参考)
    附属書2(参考) JISと対応する国際規格との対比表

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                                                                              K 0400-80-10 : 2000

pdf 目次

ページ

•  序文・・・・[1]
•  1. 適用範囲・・・・[1]
•  2. 引用規格・・・・[2]
•  3. 原理・・・・[2]
•  4. 試薬・・・・[2]
•  5. 装置・・・・[2]
•  6. サンプリング方法及び貯蔵・・・・[3]
•  7. 手順・・・・[3]
•  7.1 ろ過・・・・[3]
•  7.2 抽出方法A・・・・[3]
•  7.3 抽出方法B・・・・[3]
•  7.4 吸光度測定・・・・[4]
•  8. 計算及び試験結果の表現・・・・[4]
•  9. 精度・・・・[5]
•  10. 試験報告・・・・[5]
•  附属書A(参考) 底生植物濃度の定量・・・・[6]
•  附属書B(参考) 文献・・・・[7]
•  附属書1(参考)・・・・[8]
•  附属書2(参考) JISと対応する国際規格との対比表・・・・[9]

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                                       日本工業規格(日本産業規格)                             JIS
                                                                   K 0400-80-10 : 2000

水質−生化学的パラメータの測定−クロロフィルa濃度の吸光光度定量

Water quality−Measurement of biochemical parameters− Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration

序文

 この規格は,1992年に第1版として発行されたISO 10260, Water quality−Measurement of biochemical
parameters−Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentrationを翻訳し,技術的内容及び規格票の
様式を変更することなく作成した日本工業規格(日本産業規格)であるが,対応国際規格には規定されていない規定項目を
日本工業規格(日本産業規格)として追加している。
なお,この規格で点線の下線を施してある箇所は,原国際規格にはない事項である。
クロロフィルaは,すべての緑色植物中に必ず存在する光合成色素である。表層水中のクロロフィル含有
量は水質の栄養状態の一つの指標である。クロロフィルaの濃度を定量することによって藻類の量及び潜
在的な光合成能についての情報が得られる。クロロフィル類の最も重要な代謝産物は,フェオフィチン類
及びフェオフォルバイド (phaeoforbide) である。クロロフィルとフェオ色素の比は,藻類の生理的状態を
示すものである。

1. 適用範囲

1.1   この規格は,クロロフィルaの濃度の定量方法を規定する。この操作は,天然表層水中の植物プラ
ンクトンに適用でき,また,バイオアッセイにおける藻類成長試験に適用できる。適切なサンプリング方
法を用いれば,これは底生植物群落(付着藻類)にも適用できる(附属書A参照)。
1.2   クロロフィルb,クロロフィルcなどの藻類色素及び二,三のクロロフィル代謝産物は,試験に影響
しない。フェオ色素類はクロロフィルaの定量を妨害する。これを補正し,同時に不活性な藻類の分率を
求めるために,フェオ色素を半定量的に定量する。
1.3   クロロフィルは,特にそれが抽出されたとき,光及び酸素に対して敏感である。酸化分解及び光化
学的分解を避けるために,試料を明るい光又は空気にさらしてはならない。試料を均一にすると,場合に
よっては抽出効率が向上することがある。
1.4   エタノールによる抽出操作は75℃,5分間の加熱を伴い,これはクロロフィラーゼを不活性化し,
色素の分解 (lysis) を促進する。吸光度測定前の抽出物(懸濁物が付着したろ紙以外の)の貯蔵はできるだ
け短いことが望ましいが,4℃の冷蔵では3日間まで可能である。−25℃より低温では,抽出物は最低30
日間貯蔵は可能である。

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1.5   手順では最終抽出物を清澄にするためにろ過又は遠心分離を行うが,なお,わずかな濁りが残るこ
とがある。酸性化の段階でも濁りを生じることがある。したがって,665nmで測定した吸光度は,750nm
の吸光度を差し引いて,濁りの補正をしなければならない。
1.6   ある種の希少な光合成(栄養性)細菌 (phototrophic bacteria) [例えば,クロロビウム (Chlorobium)]
の色素は,クロロフィルaの濃度の定量の妨害になる [1]。665nmの吸光度へのクロロフィルb及びクロ
ロフィルcの寄与は無視できる [2]。
    備考 この規格の対応国際規格を,次に示す。
            なお,対応の程度を表す記号は,ISO/IEC Guide 21に基づき,IDT(一致している),MOD
          (修正している),NEQ(同等でない)とする。
          ISO 10260 : 1992, Water quality−Measurement of biochemical parameters−Spectrometric
              determination of the chlorophyll-a concentration (MOD)

2. 引用規格

 次に掲げる規格は,この規格に引用されることによって,この規格の規定の一部を構成す
る。これらの引用規格は,その最新版(追補を含む。)を適用する。
    JIS K 0410-3-1 水質−サンプリング−第1部 : サンプリング計画策定の指針
      備考 ISO 5667-1 : 1980, Water quality−Sampling−Part 1 : Guidance on the design of sampling
                programmesが,この規格と一致している。
    JIS K 0410-3-2 水質−サンプリング−第2部 : サンプリング技術の指針
      備考 ISO 5667-2 : 1991, Water quality−Sampling−Part 2 : Guidance on sampling techniquesが,この規
                格と一致している。
    JIS K 8101 エタノール (99.5) (試薬)
    JIS K 8180 塩酸(試薬)

3. 原理

 ろ過による藻類その他の懸濁物の水試料からの捕集。ろ紙上の残留物から藻類色素を熱エタノ
ールへ抽出。抽出物中のクロロフィルaの濃度の吸光光度定量。抽出物の酸性化前後における665nmの吸
光度の差からクロロフィルaとフェオ色素の濃度の算出 [3] [4]。

4. 試薬

 試薬は,分析用と認められたものだけを,また,水は分析用と同等の純度のイオン交換水だけ
を用いる。
4.1   塩酸,c (HCl)=3mol/L JIS K 8180に規定する塩酸を用いて調製する。
4.2   エタノール (C2H5OH), 90% (vol) 溶液 JIS K 8101に規定するエタノール (99.5) を用いて調製す
る。
    備考 通常,エタノールの変性剤は妨害しない。しかし,未知の各バッチについては純エタノール
          (90vol%) による比較試験を勧める [4]。

5. 装置

 通常の試験室用の装置及び
5.1   分光光度計 750nmまでの可視部用。分解能1nm,スペクトルバンド幅2nm以下,感度0.001吸光
度単位以下で,光路長15cmの吸収セルを備えたもの。
5.2   真空ろ過装置 クランプ付きのろ紙ホルダー。

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5.3   有機バインダーを含まないガラス繊維ろ紙 水試料のろ過用。1              鉛                上を捕集
できるもの。適切な直径は2550mm。
5.4   抽出物ろ過用ろ紙 5.3と同様で,直径の小さいもの。例えば,25mm。又は遠心分離器 加速度6 000G
で適切な抽出管用のローターを備えたものを用いてもよい。
5.5   恒温水槽 抽出容器用の台 (rack) を備え,75±1℃に調節できるもの。
5.6   抽出容器 例えば,四ふっ化エチレン樹脂 (PTFE) の内張りをしたねじぶた付きの広口褐色ガラス
バイアル。容量3050mlで,6 000Gの遠心分離に適したもの。

6. サンプリング方法及び貯蔵

 JIS K 0410-3-1及びJIS K 0410-3-2に従って試料を捕集する。水試料は,
冷暗所に保存すれば8時間未満は容認できるが,できれば,サンプリング直後に7.17.3を実施する。必
要があれば,抽出物をそのまま気密の褐色ガラス製の抽出容器(5.6)に−25℃以下で,30日間まで貯蔵する。
水試料又は固形物が付着したろ紙を凍結貯蔵してはならない。

7. 手順

7.1 ろ過

− 試料を振り混ぜて,よく混合する。試料の一定量Vs(藻類の濃度によって,普通0.12L)を適切な
    ホルダに取り付けたガラス繊維ろ紙(5.3)でろ過する。ろ紙を真空乾燥し,乾いたら直ちにホルダーか
    ら取り外し,抽出容器に入れる。抽出容器に収まらない場合は,ちぎって細片にする。
− 指で触れてはならない。

7.2 抽出方法A

− エタノール(4.2)の必要量を75℃に加熱する。
− ろ紙又はろ紙片の入った容器に,加熱した少量のエタノール(通常,3040ml)を注ぎ入れる。数分
    間冷却した後,抽出を容易にするために,なるべく棒状のホモジナイザーでろ紙をすりつぶす。少量
    のエタノール(4.2)でホモジナイザーを洗って,付着している試料の粒子を取り除く。この懸濁液から
    の抽出は,少なくとも3分間行う。
    備考 通常の抽出は,室温で数時間又は一夜行う。抽出が長引いたり,抽出物を数日間貯蔵する場合
          は,抽出容器は冷暗所に保存しておくことが望ましい。
− 懸濁物を目の細かいろ紙(5.4)で,全量フラスコ.(50ml又は100ml)中にろ過する。抽出容器をエタ
    ノール(4.2)で洗って残った抽出物を取り去り,ろ紙もよくすすいで,全量フラスコ中に移す。エタノ
    ールを標線まで加え,栓をしてよく混合する。これが液量Veの抽出物である。
− 7.4を行う。

7.3 抽出方法B

− エタノール(4.2)の一定量Ve(通常,20ml又は25ml)を抽出容器(5.6)にとり,これにろ紙片を浸す。
    抽出剤の蒸発損失を防ぐために,ねじぶたをしっかり閉める。少し振り混ぜて,ろ紙片 (filter residue)
    を再び懸濁させる。管を恒温水槽(5.5)中に浸し,抽出剤の水位を水槽の水位に合わせる。必要があれ
    ば,少し振り混ぜながら5分間加熱する。抽出容器を恒温水槽から取り出し,約15分間待って室温に
    冷却する。
− 抽出と測定の間の時間はなるべく短いことが望ましい。
    備考1. この段階の抽出物は,測定前一夜,冷暗所に保存してもよい(7.4参照)。貯蔵が長引いても,
            3日間を超えてはならない。

――――― [JIS K 0400-80-10 pdf 5] ―――――

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