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− 溶液I (5.4.1) 50ml,溶液III (5.4.3) 125ml,溶液IV (5.4.4) 100mlを合わせた後,水を加えて1 000mlと
する。
− 固まっていない栄養培地610mlを培養用試験管に入れ,栓をした後,121℃で10分間滅菌する。
− その栄養寒天培地を斜めに保って凝固させた後,24℃で保存する。
5.5.2 保存培地の取扱い
− 試験用の系統のシュードモナスの保存培養は,保存用培養用栄養培地 (5.5.1) の斜面寒天固体培地上
で行って保存する。
− 試験用の系統を保存するために1週間ごとに,新しい保存培地を調製する。
− この目的のために接種した保存培地を25±4℃で24時間培養する(25±4℃で保存する)。1系統を長
期間培養は,試験生物の感受性に変化を引き起こす可能性がある。このような場合は,試験には新た
に培養する。
備考 24時間の培養後に緑の色素が作られるかもしれないが,これは正常なことで,汚染菌が混入し
ているわけではない。
表1 各種培地中の最終濃度
栄養素 保存培地 (5.5) 前培養 (8.1) 試験培地 (8.2)
mg/L mg/L mg/L
NaNO3 1 000 500 500
K2HPO4 240 120 120
KH2PO4 120 60 60
酵母エキス 100 50 −
C6H12O6・H2O 10 000 2 000 2 000
MgSO4・7H2O 400 200 200
くえん酸鉄 (III) 1.0 0.5 0.5
寒天 18 000 − −
6. 材料及び装置
栄養培地の調製中及び試験中に,試験試料と触れる器具は,ガラス製か化学的に不活
性の材料でできているものとする。
試験系統と接触するガラス器具及び栓は,もし,減菌していない場合は培養液とともに,使用前に滅菌
しなければならない。
6.1 分光光度計又は濁度計 若しくは,十分な感度があり,濁度との相関性が受け入れられるものであ
るなら,別の方法で系統の生育状態を測定してもよい。
6.2 顕微鏡 最小倍率×100
6.3 pH計
6.4 温度調節器
6.5 培養フラスコ
6.6 高圧蒸気滅菌器(オートクレーブ)
7. 試料の取扱い
− 試料を採取し,準備ができたら,できるだけ早く試験する。
− 避けられない場合,試料は冷やすか(24℃で2日間まで),凍らせて(−18℃で2週間まで)保存す
る。試験試料の毒性は置いておくと変化するので,例外的な場合だけ試料を保存する。
− 必要な場合は,培地を用意する前に試料をよく振り混ぜるか,懸濁化する。
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− 試料のpHを測定する。
− 試験は,通常pHを調節せずに行う。抑制効果が異常なpHによってだけ生じるようであるなら,pH
を7.4に調節した追加試験を実施する。この場合,試験試料は塩酸 (5.2) 又は水酸化ナトリウム溶液
(5.3) を用い,pHを7.4±0.3に調節する。この操作による試験試料の変化はできるだけ小さくする。
必要な場合,例えば,試料が微生物によって高濃度に汚染されているような場合,試料はろ過によっ
て滅菌できる。しかし,これは試料の毒性の効果に変化を与える可能性がある。
8. 操作
8.1 前培養 (3.5) の準備
8.1.1 前培養用培地の準備
− 滅菌した容器に滅菌した水900mlを入れるか,水900mlを適切な容器に入れて滅菌する。
− 溶液I及びIII(5.4.1及び5.4.3)をそれぞれ25mlをとり,混ぜ合わせ,その溶液に更に溶液IV (5.4.4)
50mlを加える。
備考 前培養用培地のpHは,7.2±0.2になる。
− 前培養培地を無菌的に培養フラスコに分注する(例えば,コニカルフラスコ250mlに培地90mlずつ
を入れる。)。
8.1.2 前培養のための接種菌体の準備
− 培養後7日間までの保存株を前培養し,接種菌体の準備をする。
− 斜面寒天 (5.1.1) 培地から滅菌した前培養培地 (8.1.1) を用いて細胞を採取する。
− この細胞懸濁液を滅菌した前培養培地で薄め,前培養培地中の濁度が10FNUになるようにする。
例 前培養の体積が最終的に100mlならば,細胞懸濁液の濁度は,100FNUにまで希釈しなければい
けない。これはこの細胞懸濁液10mlには90mlの前培養培地が加えられるからである (8.1.1)。
備考1. 細菌の細胞懸濁液の吸光度は,JIS K 0400-9-10の第3章に従って,透過光の減衰を測定するよ
うな光電子的な計測(JIS K 0400-9-10の3.4),光の散乱を計測する(JIS K 0400-9-10の3.3)
などの方法によって測定する。吸光度が0.4より小さい場合にFNUの検量線を使用し,吸光
度が0.4より大きいときは懸濁液を吸光度0.10.4に薄めなければならない。
2. FNU測定の代わりに,ほかの濁度単位も使える。例えば,
A610=0.02 (10FNU)
A610=0.2 (100FNU)
A610=0.1 (50FNU)
ただし,A610は610nmにおける吸光度である。
8.1.3 培養及び接種菌体の使用
− 菌体 (8.1.2) を前培養培地 (8.1.1) に接種する。
− 培養フラスコ (6.5) を,滅菌した多孔質の栓で封じる。
− 前培養を試験 (8.3) と同じ温度で5±0.5時間培養し,細菌を懸濁状態にしておく(例えば,振り混ぜ
て)。また,フラスコの壁に沈殿物が残らないようにする(例えば,振り混ぜて)。
− 培養が終わったら,一定の濁度(例えば,50FNU)になるように菌体懸濁液を試験培養液(表1参照)
で薄める。
備考 接種菌体は,対数増殖期にある前培養から採取しなければならない。この細菌は,鎖状にはな
らないことに注意する。これは顕微鏡で観察できる。もし,繊維状のものが観察されたら,新
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たな培養菌体を用意することが望ましい。
8.2 試験培養の準備
− 希釈段階を選び(例えば,表2参照),試験試料 (3.11) とイオン交換水 (5.) とで希釈段階を準備する。
− 例えば,培養フラスコ250mlに最終の体積100mlのように,試験培養に使用する容器に合わせて,最
終的に必要な体積を準備する。最終的な体積が100mlのような次の例では,試験培養菌体は数mlの
単位で一定体積中に含まれる。
− 溶液II,III及びIV (5.4),希釈液,試験試料を培養フラスコ (6.5) に入れる。
− 次に,8.1.2によって,試験培養が計算上5FNUの濁度になるように調節した接種菌体を加える。
− 空気を通す滅菌した栓か,アルミニウムのキャップでフラスコを閉める。
− 使用可能な最高濃度は,試験試料を80%含んだ試験培地である。
− 可能であるなら,各希釈段階で同様な三つのフラスコで試験するようにする。
− 並行して試験するフラスコの数は選択した意味,必要な信頼限界,個々の測定において予想されるば
らつきに左右される。
備考 より細かく濃度こう配が設定されて測定が行われるなら,試験フラスコの数が減ってもよい。
− 試験試料が濁っていたり着色している場合は,接種菌体が入っていない希釈系列を用意する。この場
合,接種菌体はこの菌体の体積に対応する前培養培地(8.1.1)と置き変わる。
表2 試験系列の例
希釈系列 希釈水 (5.) 添加 試験試料 保存液 (5.4) 接種量 (8.1.2) 最終体積
II III IV (50FNU, 436nm)
係数,f=2 ml ml ml ml ml ml ml
対照 80 0 2.5 2.5 5 10 100
2 30 50 2.5 2.5 5 10 100
4 55 25 2.5 2.5 5 10 100
8 67.5 12.5 2.5 2.5 5 10 100
16 73.7 6.3 2.5 2.5 5 10 100
32 76.9 3.1 2.5 2.5 5 10 100
64 78.5 1.5 2.5 2.5 5 10 100
8.3 培養
− 試験培養と対照培養は,23±1℃の一定温度,暗所で実施する。
− 試験中の温度の変化は,±1℃より大きくなってはならない。
− 細菌を懸濁状態に保ち(例えば,振り混ぜる。),沈殿物がフラスコの壁に残らないようにする。
8.4 測定
− 16±1時間培養した後,振り混ぜによって懸濁状態とし,直ちに濁度を測定する。
備考 試験試料との反応によって細胞増殖中に色の変化が起きた場合は,この影響を減じる必要があ
る。測定のために他の波長を選んでもこれができないならば,対応する希釈段階の試料をろ過
してきれいにした後,吸光度を測定し,空試験値とする。この値は,単光束の光度計の場合に
は試料の測定値から差し引かなければならない。
9. 妥当性の基準
次の場合は,試験は有効であるとみなす。
− 対照 (5FNU) に使われた接種菌体が試験期間中に少なくとも60倍の係数まで増加した。
− 参照物質3.5−ジクロロフェノールのEC50が1030mg/Lの間にある。
備考 60倍という係数は,細菌の56回の細胞分裂に対応している。
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10. 結果の計算
− 個々の希釈について,試験期間(例,表3参照)の最後に生産された生物量に対応する濁度値をまと
める。
− 次のようにして,それぞれの試験濃度において細胞増幅阻害の割合 (I) を計算する。
Be Bn
I 100
Be Bo
ここに, I : 細胞増殖阻害度 (%)
Bn : 試験期間の最後における生物量として測定された濁度で,試
験試料のn番目の濃度に対応する(例えば,1:2)
Be : 試験期間の最後における対照の生物量として測定される濁度
Bo : 対照の時間toにおける生物量として最初に測定された濁度
− 対応する希釈係数に対して,それぞれの希釈濃度で計算した阻害の値 (I) をプロットする。
− EC10とEC50推定値は,それぞれ縦軸の10%と50%の値に対応する横軸(濃度)の値として求められ
る。
備考 値は,コンピュータで適切な回帰モデルを使って示してもよい。
表3 試験結果の例
希釈段階 測定値 平均値
FUN (436nm)
(f=2) 1 2 3 FNU (436nm)
1/2 23 25 24 24
1/4 58 64 64 62
1/8 128 131 139 133
1/16 290 279 282 284
1/32 426 426 403 418
1/64 455 460 450 455
対照 : 440FNU ; 448.8FNU ; 439FNU ;
460FNU ; 455FNU ; 450FNU (436nm)
11. 結果の表示
試験試料の濃度影響は,図及び表の形で(表4参照)示す。
表4 結果の表によるまとめの例
希釈段階 生長阻害 %
2 95
4 86
8 70
16 37
32 8
64 0
12. 試験報告
報告書には,次の事項を含めなければならない。
a) この規格の引用
b) 試料の特質 : 由来,日付/試料採取にかかった時間など
c) 試料の調製(適用できる場合は)
− 懸濁化,安定化,pH調節,ろ過,遠心分離などについての詳細
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d) 試験に使用した生物 : 種類,系統番号
e) 試験条件
− 試験日
− 試験装置
− 培養温度
− 試験の最初と最後のpH
− 接種菌体濃度
f) 測定の手順
− 濁度及び吸光度の測定(光度計での測定における波長など)
g) 結果の表示 (11.) と
− それぞれの濃度段階での濁度の測定値を,表によって表示(個々の値及び平均の値)
− それぞれの濃度段階における阻害値を図及び表,又はいずれかで表示
− EC10とEC50の値
− 参照物質のECの値
h) この手順とは異なるすべての事項,及び例えば,汚染菌の生長のように結果に影響した可能性のある
すべての情報。
13. 結果の解釈
報告された値は,一定の実験室条件で測定された毒性学的特質である。しかしながら,
この方法によって測定された有害な影響は,水界において望ましくない変化が起こっているということの
懸念を指示する。ただし,これはすべての場合にその水界における影響があるということを直接的に結論
づけるものではない。
14. 手順の特徴
− 1989年に21の研究室が参加して行われた試験で,3.5−ジクロロフェノールに対する次のECの値が
決定された。
EC10 : 13.7mg/L
EC50 : 21.4mg/L
− 再現性の変動係数 (VCR) は,それぞれ31.8%と23%であった。
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JIS K 0420-74-10:2000の引用国際規格 ISO 一覧
- ISO 10712:1995(MOD)
JIS K 0420-74-10:2000の国際規格 ICS 分類一覧
- 13 : 環境.健康予防.安全 > 13.060 : 水質 > 13.060.70 : 生物学的性質による水質の検査
JIS K 0420-74-10:2000の関連規格と引用規格一覧
- 規格番号
- 規格名称
- JISK0400-9-10:2000
- 水質―濁度の測定
- JISK8180:2015
- 塩酸(試薬)
- JISK8180:2021
- 塩酸(試薬)
- JISK8263:2020
- 寒天(試薬)
- JISK8562:2007
- 硝酸ナトリウム(試薬)
- JISK8576:2019
- 水酸化ナトリウム(試薬)
- JISK8995:2015
- 硫酸マグネシウム七水和物(試薬)
- JISK8995:2021
- 硫酸マグネシウム七水和物(試薬)
- JISK9007:2008
- りん酸二水素カリウム(試薬)
- JISK9017:2012
- りん酸水素二カリウム(試薬)
- JISK9017:2021
- りん酸水素二カリウム(試薬)
- JISK9809:1996
- 生化学試薬―D(+)-グルコース