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※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
序章
DNA (デオキシリボ核酸) は、生物活動に関与する酵素をコードする生物の必須成分です。さまざまなマトリックスから抽出された DNA ソースからの DNA 配列の研究は、多数の分子的アプローチによって、さまざまな生物 (細菌、古細菌、真核生物) を明確に区別および識別するために使用できる分子マーカーを提供します。
これまで、土壌などの複雑な環境に適用可能な微生物土壌品質指標の開発を目的とした研究のほとんどは、多くの微生物の培養不能性と従来の微生物学的方法の感度の欠如によって偏っていました。 [1]主に土壌抽出核酸の増幅に基づく多数の分子生物学的方法の最近の開発は、微生物群集の組成、豊富さ、および構造に対する独自の洞察を提供する、古典的な培養ベースの微生物学的方法に適切な代替手段を提供しました。 [2], [3], [4], [5], [6] DNA ベースのアプローチは現在、土壌生態学において十分に確立されており、微生物の多様性を決定するための遺伝子型 (分子遺伝学的) マーカーとして機能しています。
土壌微生物群集および/または集団の分子分析の結果は、2 つの主要なパラメーターに依存します。
- a)土着の細菌群集構成を代表する DNA の抽出。
- b)プライマーの選択、増幅された DNA の濃度、PCR のエラー、または分析のために選択された方法などの PCR バイアス。 [4], [7], [8], [9]最近、土壌からの DNA の抽出、精製、増幅、および定量化を改善する新しい方法が数多くの研究で調査されています[10] 。
第 1 版 (ISO 11063:2012) では、定量的 (q‑PCR) および定性的 (A-RISA) アプローチの両方による微生物群集の組成の研究に適した、土壌サンプルから DNA を直接抽出するために使用される手順が説明されています[11] 。
このドキュメントの目的は、最近報告された新しい方法[12]を説明することです。これは、土壌 DNA をテンプレートとして使用するポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって生成されたリボソームアンプリコンの次世代シーケンシングによって土壌微生物の多様性を分析するための初版手順から派生したものです。 .この新しい方法は、元の方法と比較して、DNA の回収率を高め、古細菌および真菌群集の存在量と構造をより適切に表すことが示されました[12] 。
Introduction
DNA (deoxyribonucleic acid) is an essential component of any living organism coding for enzymes responsible for any biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different matrices, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial soil quality indicators applicable to complex environments, such as soil, were biased by the unculturability of many microorganisms and the lack of sensitivity of traditional microbiological methods.[1] The recent development of numerous molecular biology methods based primarily on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods, providing unique insight into the composition, richness, and structure of microbial communities.[2],[3],[4],[5],[6] DNA‑based approaches are now well-established in soil ecology and serve as genotypic (molecular genetic) markers for determining microbial diversity.
The results of molecular analyses of soil microbial communities and/or populations rely on two main parameters:
- a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition;
- b) PCR bias, such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method chosen for analysis.[4],[7],[8],[9] Recently, numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification, and quantification of DNA from soils[10].
The first edition (ISO 11063:2012) described the procedure used to extract DNA directly from soil samples suitable for the study of the composition of microbial community by both quantitative (q‑PCR) and qualitative (A-RISA) approaches[11].
The aim of this document is to describe a new method recently reported[12] derived from the first edition procedure to analyse the diversity of soil microorganisms by next‑generation sequencing of ribosomal amplicons generated by polymerase chain reactions (PCR) using soil DNA as template. This new method was shown to increase the DNA recovery and to better represents the abundance and the structure of archaeal and fungal communities as compared to the original method[12].