この規格 プレビューページの目次
※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
序章
全般的
油脂（すなわち、液体および固体脂質）は、主にグリセロールの脂肪酸エステル（トリアシルグリセロール、TAG）で構成され、少量のステロールの脂肪酸エステルおよび脂肪族アルコールの長鎖が含まれます。 TAG は分子量が高く、その結果揮発性が低いため、特に不飽和脂肪酸の詳細な分析が必要な場合、ガスクロマトグラフィー (GC) で直接分析することは困難です。脂肪酸自体は十分にクロマトグラフできません (ブタン酸やペンタン酸などの短鎖長の脂肪酸を除く)したがって、GC の前に脂肪酸エステル、通常は脂肪酸メチルエステル (FAME) を形成することをお勧めします。
油脂の分析については、参考文献 [9] で詳しく説明されています。
FAME の形成は、脂肪酸の分析における重要な段階です。脂肪酸の FAME への非定量的変換、脂肪酸の構造の変更 (存在する位置および幾何異性体の変化など)、および非 FAME アーティファクトの形成はすべて、脂肪酸組成の定量的決定に影響を与える可能性があります。
エステル交換は、脂肪中の脂肪酸エステル (すなわち、トリアシルグリセロール) から FAME を形成するために使用できるメカニズムの 1 つです。アルカリ触媒または酸触媒によるエステル交換手順を使用して、メタノール媒体中で FAME を形成できます。この手順はトランスメチル化と呼ばれます。トランスメチル化は可逆的なプロセスであり、FAME の形成に有利な平衡位置を維持するには大過剰のメタノールが必要です。水は反応の完了を妨げる可能性があるため、その存在は最小限に抑える必要があります。アルカリ触媒法では、石鹸が形成されるため、遊離脂肪酸から FAME は生成されません。
エステル化は、脂肪酸から FAME を形成するために使用できる酸触媒メカニズムです。検査中の脂肪サンプルに脂肪酸が自然に存在する可能性があります。このメカニズムによる FAME の形成は、一般にメチル化と呼ばれます。繰り返しますが、過剰なメタノールと水の不在は、FAME の定量的形成の前提条件です。
この文書は、脂肪酸メチルエステルの調製に関するガイドラインを提供します。これらのガイドラインをサポートするために、脂肪酸メチルエステルを調製するためのさまざまな手順が指定されています。これらには次のものが含まれます。
- a)アルカリ性条件下での「急速な」メチル基転移;
- b)一連のアルカリ性および酸性条件下での「一般的な」トランスメチル化/メチル化。
- ｃ）三フッ化ホウ素（ＢＦ ３ ）トランスメチル化／メチル化。
アルカリ触媒条件下での「迅速な」トランスメチル化法
このメソッドは、ブタン酸 (C4:0) までの脂肪酸を含む食用油脂のルーチン分析や、内部標準を使用した GC によるブタン酸またはヘキサン酸 (C6:0) の測定に適用できます。
アルカリ触媒は、無水メタノールの存在下で酸触媒よりも迅速に中性脂質をエステル交換 (メチル基転移) します。このようなアルカリ触媒手順の欠点は、遊離脂肪酸がエステル化されず、水の存在によりトランスメチル化が完了するのを妨げる可能性があることです (遊離脂肪酸への FAME の加水分解)最も一般的に使用される試薬は、無水メタノールの存在下での水酸化カリウムと水酸化ナトリウム、およびナトリウム メトキシドです。
連続したアルカリ性および酸性条件下での「一般的な」トランスメチル化/メチル化
連続したアルカリ性および酸触媒条件下でのこの方法は、留出油および酸性油を含むすべての油脂に適用できますが、ラウリン油には推奨されません.短鎖脂肪酸メチルエステルは、還流中に容易に失われます。ラウリン酸油の場合、「迅速な」トランスメチル化法が推奨されます。
メチル化中に、次の構成を含む物質は完全または部分的に分解されます。
- ａ）ケト、エポキシ、ヒドロキシル、ヒドロペルオキシ基；
- b)シクロプロピルおよびシクロプロペニル基;
- c)アセチレン脂肪酸。
三フッ化ホウ素 (BF 3 ) トランスメチル化/メチル化
BF 3は毒性があるため、この方法は極限状態でのみ使用することをお勧めします。
BF 3メソッドは、特定の基を持つ脂肪酸を含む乳脂肪および脂肪を除いて、ほとんどの油、脂肪、および誘導体 (脂肪酸、石鹸) に適用できます。
メチル化中に、次の構成を含む物質は完全または部分的に分解されます。
- ａ）ケト、エポキシ、ヒドロキシル、ヒドロペルオキシ基；
- b)シクロプロピルおよびシクロプロペニル基;
- c)アセチレン脂肪酸。
脂肪質にそのような物質がごく少量しか含まれていない場合（綿実油など）、この方法を適用できます。それ以外の場合は、「迅速」または「一般的な」トランスメチル化/メチル化法に従う必要があります。
GC の場合、イソオクタン (2,2,4-トリメチルペンタン) を使用すると、反応混合物からメチルエステルを最適に回収できます。しかし、存在するカプロン酸メチルの約 75% しか回収されません。
三フッ化ホウ素は強力なルイス酸であり、メタノールとの配位錯体の形で、還流条件下で脂肪酸を急速にメチル化することができます。メタノール性三フッ化ホウ素は、脂肪酸エステル (トリグリセリドなど) をトランスメチル化しますが、反応速度は脂肪酸のメチル化よりも遅くなります。メタノール三フッ化ホウ素溶液は市販されており、この酸触媒の魅力を高めますが、この試薬の使用に関連する潜在的な欠点があります。
- a)高濃度の三フッ化ホウ素 (質量分率 50%) は、不飽和脂肪酸からメトキシ アーティファクトを生成することが報告されています。
- b)試薬は周囲温度での有効期間が限られているため、冷蔵保存する必要があります。
- c)古い試薬はアーティファクトを生成する可能性があるため、購入した新しいバッチごとに、使用前および寿命の間定期的にテストすることをお勧めします。
- d)メタノール性三フッ化ホウ素は酸性試薬であるため、不安定な基を含む脂肪酸の誘導体を生成する可能性があり、FAME クロマトグラムで疑似ピークを引き起こす可能性があります。
追加情報
GC による短鎖脂肪酸のエステルの調製と分析は、主に乳脂肪に含まれるため、多くの注目を集めてきました。遊離状態またはグリセロールにエステル化された短鎖脂肪酸は、前の段落で説明した試薬のいずれかによって完全にメチルエステルに変換できますが、特別な注意が払われない限り、反応媒体からの定量的な回収は達成されない場合があります。損失は、どの手順でもいくつかの段階で発生する可能性があります。短鎖脂肪酸エステル (特にメチル) は揮発性であり、エステル化媒体の還流時に選択的に失われる可能性があります。それらは長鎖エステルよりも水に溶けやすく、水性抽出ステップで失われるか、抽出溶媒が蒸発するときに留去される可能性があります。非ケン化不純物を昇華または薄層クロマトグラフィー (TLC) 精製によって除去する必要がある場合にも、選択的な損失が発生する可能性があります。短鎖脂肪酸の最適なエステル化手順は、試薬の加熱が回避され、水による抽出と溶媒除去を含む段階が存在しない手順です。
塩基性および酸性のエステル化触媒を含む反応媒体を GC カラムに直接注入すると、カラムの耐用年数が短くなります。充填されたカラムの上部数センチメートルは定期的に補充できますが、キャピラリーカラムの前にある長さの不活性化されたチューブまたは「リテンションギャップ」がカラムを保護します。これは、これらの手順の速度、単純さ、および正確さに対して支払う小さな代償である可能性があります.
さらに、このドキュメントでは、トランスメチル化/メチル化の有効性を確認するための簡単な TLC 手順を示します。この手順は、トランスメチル化/メチル化が行われる前に油脂の一般的な組成を確認するためにも使用できます。
Introduction
General
Oils and fats (i.e. liquid and solid lipids) are predominantly composed of fatty acid esters of glycerol (triacylglycerols, TAGs), with smaller amounts of fatty acid esters of sterols and long chain of aliphatic alcohols. Due to the high molecular mass of the TAGs and their consequent low volatility, they are difficult to analyse directly by gas chromatography (GC), especially if a detailed analysis of unsaturated fatty acids is required. Fatty acids themselves do not chromatograph well (except for short-chain-length fatty acids, e.g. butanoic and pentanoic acids). It is therefore better practice to form fatty acid esters, usually the fatty acid methyl esters (FAMEs), prior to GC.
The analysis of oils and fats has been extensively reviewed in Reference [9].
The formation of FAMEs is a critical stage in the analysis of fatty acids. Non-quantitative conversion of fatty acids to FAMEs, modification of the structure of fatty acids (e.g. changes in positional and geometric isomers present) and formation of non-FAME artefacts may all affect the quantitative determination of fatty acid composition.
Transesterification is one mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acid esters in fats (i.e. triacylglycerol). Alkali- or acid-catalysed transesterification procedures can be used to form FAMEs in a methanolic medium; the procedure can be termed transmethylation. Transmethylation is a reversible process and a large excess of methanol is required to maintain an equilibrium position which favours formation of the FAMEs. Water can prevent the reaction going to completion, and its presence should therefore be minimized. Alkali-catalysed procedures do not produce FAMEs from free fatty acids, due to the formation of soaps.
Esterification is an acid-catalysed mechanism which can be employed to form FAMEs from fatty acids. It is possible that the fatty acids are naturally present in the sample of fat under examination. Formation of FAMEs by this mechanism is commonly termed methylation. Again, an excess of methanol and the absence of water are preconditions for the quantitative formation of FAMEs.
This document provides guidelines for the preparation of fatty acid methyl esters. In support of these guidelines, various procedures to prepare fatty acid methyl esters are specified. These include the following:
- a) “rapid” transmethylation under alkaline conditions;
- b) “general” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions;
- c) boron trifluoride (BF3) transmethylation/methylation.
“Rapid” transmethylation method under alkali-catalysed conditions
This method is applicable to the routine analysis of edible fats and oils containing fatty acids down to butanoic acid (C4:0) and/or for the determination of butanoic acid or hexanoic acid (C6:0) by GC using an internal standard.
Alkaline catalysts transesterify neutral lipids in the presence of anhydrous methanol (transmethylation) more rapidly than acid catalysts. The disadvantages of such alkali-catalysed procedures are that free fatty acids are not esterified, and the presence of water may prevent the transmethylation going to completion (hydrolysis of the FAMEs to free fatty acids). The most commonly used reagents are potassium and sodium hydroxide and sodium methoxide in the presence of anhydrous methanol.
“General” transmethylation/methylation under sequential alkaline and acid conditions
This method under sequential alkali- and acid-catalysed conditions is applicable to all oils and fats including distillate and acid oils, but is not recommended for lauric oils. Short-chain fatty acid methyl esters are easily lost during reflux. For lauric acid oils, the “rapid” transmethylation method is recommended.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially decomposed:
- a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
- b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
- c) acetylenic fatty acids.
Boron trifluoride (BF3) transmethylation/methylation
Owing to the toxicity of BF3 it is recommended that this method only be used in extremis.
The BF3 method is applicable for most oils, fats and derivatives (fatty acids, soaps) with the exception of milk fats and fats containing fatty acids with specific groups.
During methylation, substances containing the following configurations can be totally or partially decomposed:
- a) keto, epoxy, hydroxyl, hydroperoxy groups;
- b) cyclopropyl and cyclopropenyl groups;
- c) acetylenic fatty acids.
If the fatty matter contains such substances in only very small amounts (e.g. cottonseed oil), the method can be applied; otherwise, the “rapid” or “general” transmethylation/methylation methods should be followed.
For GC, the optimum recovery of the methyl esters from the reaction mixture is obtained by using isooctane (2,2,4-trimethylpentane). However, only about 75 % of the methyl caproate present is recovered.
Boron trifluoride is a strong Lewis acid, and in the form of its coordination complex with methanol, under reflux conditions, it can rapidly methylate fatty acids. Methanolic boron trifluoride does transmethylate fatty acid esters (e.g. triglyceride), but the rate of reaction is slower than the methylation of fatty acids. Methanolic boron trifluoride solution is commercially available, which enhances the attractiveness of this acid catalyst, but there are potential disadvantages associated with the use of this reagent.
- a) It has been reported that high concentrations of boron trifluoride (50 % mass fraction) produce methoxy artefacts from unsaturated fatty acids.
- b) The reagent has a limited shelf-life at ambient temperature and should be kept refrigerated.
- c) Aged reagent can produce artefacts and therefore, it is recommended that each new batch purchased be tested before use and periodically during its lifetime.
- d) Methanolic boron trifluoride is an acidic reagent and therefore can produce derivatives of fatty acids containing labile groups which can give rise to spurious peaks on FAME chromatograms.
Additional information
Much attention has been given to the preparation and analysis of esters of short-chain fatty acids by GC, largely because of their occurrence in milk fats. Short-chain fatty acids, in the free state or esterified to glycerol, can be converted completely to methyl esters by any of the reagents described in the preceding paragraphs, but quantitative recovery from the reaction medium may not be achieved unless special precautions are taken. Losses can occur at several stages in any procedure. Short-chain fatty acid esters (methyl especially) are volatile and may be lost selectively on refluxing the esterification medium; they are more soluble in water than longer-chain esters and can be lost in an aqueous extraction step or they may be distilled off when the extracting solvent is evaporated. Selective losses can also occur if non-saponifiable impurities have to be removed by sublimation or thin-layer chromatography (TLC) purification. The best esterification procedures for short-chain fatty acids are those in which heating of the reagents is avoided and in which stages involving aqueous extraction and solvent removal are absent.
Injection of reaction media containing basic and acidic esterification catalysts directly on to GC columns shortens their working lives. The top few centimetres of packed columns can be replenished periodically, while lengths of deactivated tubing or “retention gaps” ahead of capillary columns protect them. This can be a small price to pay for the speed, simplicity and accuracy of these procedures.
Additionally, this document gives a simple TLC procedure to check the effectiveness of the transmethylation/methylation. This procedure may also be used to check the generic composition of an oil or fat before transmethylation/methylation is undertaken.