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※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
導入
DNA (DNA) は、生物活性の原因となる酵素をコードするあらゆる生物の主要な構成要素です。さまざまな環境マトリックスから抽出された DNA ソースからの DNA 配列をさまざまなアプローチで研究すると、さまざまな生物 (細菌、古細菌、真核生物) を分子的に明確に区別および識別するために使用できる分子マーカーが得られます。
これまで、土壌などの複雑な環境に適用できる微生物の品質指標の開発を目的とした研究のほとんどは、実験室条件下での多くの微生物の培養能力の低さと、伝統的な微生物学的手法の感度の欠如によって偏っていました。土壌抽出された核酸の増幅に基づく一連の分子生物学的手法の最近の開発により、古典的な培養に基づく微生物学的手法に代わる適切な手法が提供され、微生物群集の組成、豊富さ、構造についての独自の洞察が得られました。 [ 2] [ 3] [ 4] [ 5] [ 6] DNA ベースのアプローチは現在土壌生態学で十分に確立されており、微生物の多様性を決定するための遺伝子型マーカーとして機能します。土壌微生物群集および/または土壌微生物群集の分子分析の結果は、2 つの主なパラメータに依存します: a) 土着の細菌群集組成を代表する DNA の抽出、および b) プライマーの選択、増幅された DNA の濃度、 PCR のエラー、または分析に選択された方法のエラーも含まれます。 [ 7] [ 4] [ 8] [ 9]
土壌からの DNA の抽出、精製、増幅、定量を改善するための新しい方法が数多くの研究で研究されています。 [ 10] 最近、参考文献 [10] に基づいて「土壌サンプルから直接核酸を抽出する方法」を報告した ISO 11063 は、土壌品質を推定するための標準化された分子アプローチを開発するための新しい窓を開きました。 [ 11]
この国際規格の目的は、土壌微生物門の存在量と土壌サンプルから直接抽出された DNA の官能基を定量するための定量的 PCR の設定と実行に使用される手順を記述することです。 qPCR アッセイによる土壌微生物門および官能基の定量化は、土壌の品質を監視するための日常的なツールの開発に貢献できます。定量的 PCR の手順の再現性と再現性は、国際リングテスト研究で評価されました (付録 B を参照)この手順の再現性は、16S rRNA 遺伝子と脱窒物質の機能マーカー (亜硝酸レダクターゼ遺伝子nirK ) をコードする遺伝子の両方について首尾よく評価されました。この手順の再現性により、アッセイで外部参照 (対照株から抽出した DNA) を使用するか、または計算によって微生物グループの存在量の定量化の結果を比較解釈することによって克服できる実験室効果が明らかになりました。データを正規化するための治療間の変動のパーセンテージ。
Introduction
DNA (DNAs) is a major component of any living organisms coding for enzymes responsible for their biological activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different environmental matrices, by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can be used to sharply distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea, and eucaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial quality indicators applicable to complex environment such as soil were biased by the poor culturability of many microorganisms under laboratory conditions and the lack of sensitivity of traditional microbiological methods. The recent development of a large set of molecular biology methods based on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided a pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods providing unique insight into the composition, richness, and structure of microbial communities.[2][3][4][5][6] DNA-based approaches are now well established in soil ecology and serve as genotypic markers for determining microbial diversity. The results of molecular analyzes of soil microbial communities and/or populations rely on two main parameters: a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition and b) PCR bias such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method chosen for analysis.[7][4][8][9]
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification, and quantification of DNA from soils.[10] Recently, ISO 11063 reporting “a method to extract nucleic acids directly from soil samples“ derived from Reference [10] is opening a new window for developing standardized molecular approaches to estimate soil quality.[11]
The aim of this International Standard is to describe the procedure used to set up and perform quantitative PCR to quantify the abundance of soil microbial phyla, as well as functional groups from DNA directly extracted from soil samples. The quantification of soil microbial phyla, as well as functional groups by qPCR assays can contribute to the development of routine tools to monitor soil quality. The repeatability and the reproducibility of the procedure of the quantitative PCR were assessed in an international ring test study (see Annex B). The repeatability of this procedure was successfully evaluated for both 16S rRNA genes, as well as genes coding a functional marker of denitrifiers (the nitrite reductase gene nirK). The reproducibility of this procedure revealed a laboratory effect which can be overcome by interpreting the results of the quantification of the abundance of the microbial groups by comparison, either by using an external reference (DNA extracted from a control strain) in the assay or by calculating a percentage of variations between treatments to normalize the data.