この規格 プレビューページの目次
※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
3 用語、定義、記号および略語
3.1 用語と定義
このドキュメントでは、次の用語と定義が適用されます。
ISO と IEC は、次のアドレスで標準化に使用する用語データベースを維持しています。
3.1.1
レジオネラ
<遺伝子型の定義> 特定の 16S rRNA をコードする遺伝子の DNA 配列によって定義できる細菌属
注記 1 rRNA は ribosomal ribonucleic acid の略語である。
3.1.2
レジオネラ・ニューモフィラ
<遺伝子型の定義> レジオネラ (3.1.1) 属に属する種で、その特定の DNA 配列によって定義できます。
注記 1レジオネラ属との区別。 Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａとＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａは、マクロファージ感染性増強因子（ ｍｉｐ ）遺伝子の塩基配列の違いに基づいて作製することができる。
3.1.3
リバースプライマー
フォワードプライマー
特定の DNA 複製のテンプレートとして機能する一本鎖 DNA フラグメント (オリゴヌクレオチド)
注記1フォワードプライマーとリバースプライマーの両方のDNA配列の選択により、複製されるDNA断片が決まります。プライマーの長さは通常、15 ～ 30 ヌクレオチドです。
3.1.4
サンプル
一本鎖 DNA フラグメント、特定の配列を標的とし、フルオロフォア レポーターおよびフルオロフォア クエンチャーで標識
注記 1:プローブがテンプレート DNA に結合していないか結合している間、ポリメラーゼが作用する前に、消光剤がレポーターからの蛍光を減少させます。
3.1.5
定量的 PCR
qPCR
標識された蛍光プローブによって強調表示され、リアルタイムで監視される特定の DNA フラグメントの形成
注記 1:蛍光の強度は、アンプリコンの量の尺度です。検量線との比較により、DNA ターゲットの初期濃度を決定できます。
3.1.6
Ct
閾値サイクル
DNA の濃度が検出限界を超えるように、サンプルに元々存在する DNA コピーを複製するのに必要な PCR サイクル (変性および増幅) の数。
注記1:Ct値は、サンプルのDNA濃度を蛍光ベースラインで表す線の切片です。 Ct値は、使用するソフトウェアによっては Cq 値に相当します。
3.1.7
レジオネラ菌ゲノムユニット
gu
レジオネラ属の単一のコピーを表すユニット。細菌ゲノムDNA
3.1.8
マクロファージ感染力増強遺伝子
mip 遺伝子
レジオネラ属に存在する遺伝子。宿主（原生動物）とマクロファージ（ヒト）の感染に不可欠です
注記1:L. pneumophilaのmip遺伝子の固有の塩基配列は,L. pneumophilaの特異的qPCR検出のためのプライマーおよびプローブ配列の設計に使用できる.
3.1.9
PCR阻害コントロール
レジオネラ菌に必要なプライマーを使用して、サンプル DNA 抽出物と共増幅する必要があるキャリブレーションされた DNまたはL. pneumophilaの検出
注記 1: PCR 阻害コントロールは、サンプル DNA 抽出物中の阻害剤の存在を明らかにする必要があります。
注記2コントロールは、プラスミド、オリゴヌクレオチド、またはL. pneumophilaのゲノムDNAであり得る。特異的なプローブを使用して、阻害コントロールを検出します。
3.1.10
回復
DNA抽出法の効率
3.1.11
レジオネラ・ニューモフィラDNA 一次標準
L. pneumophila (WDCM 00107) のキャリブレーションされた DNA 溶液と、既知の量のゲノム単位および関連する不確実性
注記 1:標準は、ワーキング キャリブレーション DNA 溶液を調整するために使用されます。
注記 2: WDCM カタログについては、参考文献 [3] を参照してください。
3.1.12
参考資料
L. pneumophila DNA 一次標準 (3.1.13) に接続された、すぐに使用できる校正済み DNA 溶液
注記 1: qPCR の精度をチェックするために、各 PCR ランで標準物質を処理する必要があります。
3.1.13
増幅シリーズ
同じ PCR 試薬バッチ、同じ材料、同じ機器を使用した一連の PCR 増幅ラン
3.1.14
ワーキングキャリブレーションソリューション
L. pneumophila (WDCM 00107) DNA キャリブレーション溶液と、 L. pneumophila DNA 一次標準を比較して、検量線を確立するために使用
注記1手順は7.4に規定されている。
3.1.15
Taq DNA ポリメラーゼ
in vitro DNA ポリメラーゼ反応に使用されるThermophilus aquaticus由来の酵素
3.1.16
ネガティブコントロール
この方法の全プロセスを監視するためのコントロール (ろ過から抽出、qPCR まで)
3.1.17
MgCl2
二価のカチオン型マグネシウムは、DNA ポリメラーゼ活性の必須補因子です。
注記1 dNTPと可溶な複合体を形成する。
3.1.18
dNTP
- dATP: 2'-デオキシアデノシン 5'-三リン酸。
- dTTP: 2'-デオキシチミジン 5'-三リン酸。
- dCTP: 2'-デオキシシチジン 5'-三リン酸。
- dGTP: 2'-デオキシグアノシン 5'-三リン酸
3.2 記号と略語
| LD qPCR | (qPCR の検出限界) 90% の信頼度で qPCR で肯定的な結果を与えるゲノム単位の最小数 |
| LDメタ | (qPCR の検出限界) ろ過されたサンプルのボリュームで検出される可能性のあるゲノム単位の最小数 |
| QPCR | (qPCR の定量限界) 0.15log 10単位以下の精度で定量できるゲノム単位の最小数 |
| LQ覚醒剤 | (qPCR の定量限界) ろ過されたサンプルの量で定量化される可能性のあるゲノム単位の最小数 |
| BSA | ウシ血清アルブミン |
| DMSO | ジメチルスルホキシド |
参考文献
| [1] | NCBI遺伝子バンクデータベース。入手可能 (2012 年 10 月 12 日閲覧): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html |
| [2] | EMBL 塩基配列データベース。入手可能 (2012 年 10 月 12 日閲覧): http://www.ebi.ac.uk/embl |
| [3] | World Data C enter for M icroorganisms 、性能試験用培地の生物に関する参考菌株カタログ。入手可能 (2012 年 10 月 12 日): http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf |
| [4] | 2004 年 10 月、環境サンプルの PCR 分析を実施するラボ向けの品質保証/品質管理 ガイダンス。 |
| [5] | Wellinghausen N, Frost C, Marre R (2001) 定量的リアルタイム LightCycler PCR によるレジオネラおよび病院の水サンプルの検出。 Appl Environ Microbiol 67, pp. 3985-3993 |
| [6] | Wullings BA, Bakker G, van der Kooij D, (2011) 未培養レジオネラ種の濃度と多様性。異なる濃度の天然有機物を含む 2 つの塩素処理されていない飲料水供給。 Appl Environ Microbiol. 77, 634～41ページ |
3 Terms, definitions, symbols and abbreviated terms
3.1 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
3.1.1
Legionella
<genotype definition> bacterial genus which can be defined by DNA sequences of genes encoding its specific 16S rRNA
Note 1 to entry: rRNA is the abbreviation of ribosomal ribonucleic acid.
3.1.2
Legionella pneumophila
<genotype definition> species belonging to the Legionella (3.1.1) genus which can be defined by its specific DNA sequences
Note 1 to entry: The distinction between Legionella spp. and L. pneumophila can be made on the basis of the difference between the nucleotide sequence in the macrophage infectivity potentiator (mip) gene.
3.1.3
reverse primer
forward primer
single-strand DNA fragment (oligonucleotide) that serves as a template for specific DNA replication
Note 1 to entry: The choice of the DNA sequences of both the forward and reverse primers determines which DNA fragment is replicated. The length of the primer usually varies from 15 to 30 nucleotides.
3.1.4
probe
single-stranded DNA fragment, targeting a specific sequence, labelled with a fluorophore reporter and a fluorophore quencher
Note 1 to entry: While the probe is unattached or attached to the template DNA and before the polymerase acts, the quencher reduces the fluorescence from the reporter.
3.1.5
quantitative PCR
qPCR
formation of specific DNA fragments which is highlighted by a labelled fluorescent probe and monitored in real time
Note 1 to entry: The intensity of the fluorescence is a measure of the amount of amplicons. By comparison with a calibration curve, the initial concentration of the DNA target can be determined.
3.1.6
Ct value
threshold cycle
number of PCR cycles (denaturation and amplification) required to replicate the DNA copies originally present in the sample, so that the concentration of DNA exceeds the detection limit
Note 1 to entry: The Ct value is the intercept of the line that represents the DNA concentration of a sample with fluorescent base line. Ct value is equivalent to Cq value depending on the software used.
3.1.7
Legionella spp. genome unit
gu
unit representing a single copy of the Legionella spp. bacterial genomic DNA
3.1.8
macrophage infectivity potentiator gene
mip gene
gene present in Legionella spp. which is essential for the infection of the host (protozoa) and macrophages (humans)
Note 1 to entry: The unique base sequence of the mip gene of L. pneumophila can be used for the design of the primer and probe sequences for the specific qPCR detection of L. pneumophila.
3.1.9
PCR inhibition control
calibrated DNA that is required to be co-amplified with the sample DNA extract using the primers needed for Legionella spp. or L. pneumophila detection
Note 1 to entry: The PCR inhibition control should reveal any inhibitor presence in the sample DNA extract.
Note 2 to entry: The control can be a plasmid, an oligonucleotide or the L. pneumophila genomic DNA. A specific probe shall be used to detect the inhibition control.
3.1.10
recovery
efficiency of the DNA extraction method
3.1.11
Legionella pneumophila DNA primary standard
calibrated DNA solution of L. pneumophila (WDCM 00107) with a known quantity of genome units and an associated uncertainty
Note 1 to entry: The standard is used to adjust the working calibration DNA solutions.
Note 2 to entry: For the WDCM catalogue, see Reference [3].
3.1.12
reference material
ready-to-use calibrated DNA solution connected to the L. pneumophila DNA primary standard (3.1.13)
Note 1 to entry: The reference material shall be processed in each PCR run to check the accuracy of the qPCR.
3.1.13
amplification series
set of PCR amplification runs while using the same PCR reagent batches, same materials, and same instruments
3.1.14
working calibration solutions
L. pneumophila (WDCM 00107) DNA calibrated solutions, compared to the L. pneumophila DNA primary standard, used to establish the calibration curve
Note 1 to entry: The procedure is specified in 7.4.
3.1.15
Taq DNA polymerase
enzyme from Thermophilus aquaticus used for in vitro DNA polymerase reaction
3.1.16
negative control
control for monitoring the whole process in this method (from filtration to extraction to qPCR)
3.1.17
MgCl2
magnesium in its divalent cationic form is an essential co-factor of DNA polymerase activity
Note 1 to entry: It forms a complex that is soluble with the dNTP.
3.1.18
dNTP
- dATP: 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate;
- dTTP: 2'-deoxythymidine 5'-triphosphate;
- dCTP: 2'-deoxycytidine 5'-triphosphate;
- dGTP: 2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate
3.2 Symbols and abbreviated terms
| LDqPCR | (detection limit of the qPCR) lowest number of genome units that give a positive result in the qPCR with 90 % confidence |
| LDmeth | (detection limit of the qPCR) lowest number of genome units that might be detected in the volume of sample filtrated |
| LQqPCR | (quantification limit of the qPCR) lowest number of genome units that can be quantified with an accuracy less than or equal to 0,15log10unit |
| LQmeth | (quantification limit of the qPCR) lowest number of genome units that might be quantified in the volume of sample filtrated |
| BSA | bovine serum albumine |
| DMSO | dimethyl sulfoxide |
Bibliography
| [1] | NCBI Genbank database. Available (viewed 2012-10-12) at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html |
| [2] | EMBL Nucleotide sequence database. Available (viewed 2012-10-12) at: http://www.ebi.ac.uk/embl |
| [3] | World Data Center for Microorganisms, Reference strain catalogue pertaining to organisms for performance testing culture media. Available (2012-10-12) at: http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf |
| [4] | Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples October 2004. Available at: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/epa-qaqc-pcr.pdf |
| [5] | Wellinghausen N., Frost C., Marre R., (2001) Detection of Legionellae in hospital water samples by quantitative real-time LightCycler PCR. Appl Environ Microbiol 67, pp. 3985–3993 |
| [6] | Wullings BA, Bakker G, van der Kooij D, (2011) Concentration and diversity of uncultured Legionella spp. in two unchlorinated drinking water supplies with different concentrations of natural organic matter. Appl Environ Microbiol. 77, pp. 634-41 |