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※一部、英文及び仏文を自動翻訳した日本語訳を使用しています。
F.4.1 顕微鏡 、位相差付き、スライドとカバーガラス付き。
F.5 手順
F.5.1 胞子形成寒天上での分離
HCT 寒天上で 9.4.1 で得られた 1 つの十分に分離されたコロニーをストリークし、30 °C ± 1 °C で 24 h ± 3 h およびその後の 24 h ± 3 h の期間、最大 4 期間インキュベートします。
9.4.1 でのインキュベーション後の非選択的寒天の保存は、HCT 寒天での分離前に 5 °C ± 3 °C で最大 72 時間許可されます。
また、F.6 に従って同等の結果が得られることが示されている場合は、他の胞子形成培地を使用することもできます。
F.5.2 顕微鏡検査
HCT寒天上での各インキュベーション期間の後、次のようにウェットマウント顕微鏡検査に進みます。
- 約 10 μl の水で少量のバチルス培養物を顕微鏡スライド上で乳化し、カバー スリップ上のエマルジョンの上に置きます。気泡が入らないようにしてください。 (カバー スリップの一方の端をスライドに置き、つまようじの端を使用してもう一方の端をゆっくりと下げます。これにより、気泡がカバー スリップの下に閉じ込められるのを防ぐことができます)検査を妨げる可能性のある細菌細胞の動きを減らすためにスライド。
- 次に、100X 油浸対物レンズを使用して、位相差で調べます。
- 胞子は楕円形で、胞子嚢を膨張させず、明らかに屈折しています。
- パラスポラル結晶は、胞子よりも小さい楕円形から四角形（「ダイヤモンド形」）の非屈折性封入体です。四角形よりも楕円形が多く見られます。
- これらのタンパク質毒素結晶は、特に細菌細胞から放出された後、他の封入体と区別するのがやや困難です。したがって、これらの結晶の観察は、胞子とともに細菌細胞内に存在する状態、つまり副胞子状態で行う必要があります。
傍胞子結晶は、次の特性を示す必要があります。
- 屈折性胞子とともに細菌細胞内に観察される（ほとんどの細菌細胞が胞子を含まない胞子および/または胞子を含まない包含を保有する場合、その菌株はタンパク質毒素結晶を産生しないと見なされる）;
- 最小サイズ (胞子の約 1/4 から 1/2) を有する: たとえ胞子と一緒に存在する場合でも、より小さい含有物または粒状の形状は、タンパク質毒素の結晶とはみなされない.
図 F.1, F.2, および F.3 は、パラスポラル結晶を生成する、または生成しないさまざまなB. cereusグループ株の特徴と、結論付けることのできない株の例を示しています。
胞子形成が完了するとすぐに（胞子を示す細胞のほとんど）、インキュベーションを停止する必要があります。
表 F.1 に示した 2 つの菌株について、試験した菌株を並行して調べることが役立つ場合があります。
F.5.3 結果の解釈
顕微鏡検査によると、結果は次のように解釈されます。
- パラスポラル結晶を生成する菌株：この菌株はB. thuringiensis種に属します。
- 副胞子結晶を生成しない菌株: 副胞子結晶を生成しないB. cereusグループの菌株で、 B. thuringiensisである可能性は非常に低いです。
実験室がパラスポラル結晶の生産を明確に確立できない場合、その菌株は未定義のB. cereusグループ種に属していることを述べる必要があります。
菌株が胞子形成していない場合（4 回の培養期間後）、手順（F.5.1 から F.5.3 を参照）を繰り返すことができます。胞子形成が観察されない場合、菌株は未定義のB. cereusグループ種に属していることを示す必要があります。胞子形成がないことは、試験結果に注意する必要があります。
表 F.1 - HCT 寒天の性能試験
| 関数 | インキュベーション | コントロール株 | 基準 |
|---|---|---|---|
| 包括性 | 30℃±1℃で24時間±3時間 （1～2回） | B. thuringiensis WDCM 00221 | 1～2回の潜伏期の後、傍胞子結晶の存在 |
| 排他性 | 30℃±1℃で24時間±3時間 （1～2回） | B. cereus WDCM 00001 | 1～2回の潜伏期の後、胞子の存在/副胞子結晶の不在 |
図 F.1 — 4 つの異なる菌株の顕微鏡検査 (インキュベーション時間 = 48 時間)
Key
| 1 | 胞子 |
| 2 | 傍胞子結晶 |
非屈折体と胞子は、ほとんどの細胞に存在します。
- 解釈: 傍胞子結晶を産生する菌株 = Bacillus thuringiensis
図 F.2 — 2 つの異なる菌株の顕微鏡検査 (インキュベーション時間 = 48 時間)
ほとんどの細胞には胞子のみが存在します。
- 解釈：パラスポラル結晶を産生しないB. cereusグループ株
図 F.3 —解釈が困難な菌株の顕微鏡検査 (インキュベーション時間 = 48 時間)
不均一な胞子形成、封入体/顆粒体の存在、時には胞子を伴う:
- 解釈: 定義されていないB. cereusグループ株
F.4.1 Microscope , with phase-contrast, and with slides and cover slips.
F.5 Procedure
F.5.1 Isolation on sporulating agar
Streak one well isolated colony obtained in 9.4.1 on HCT agar and incubate at 30 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h and subsequent periods of 24 h ± 3 h, for a maximum of four periods.
Storage of the non-selective agar after incubation in 9.4.1 is allowed for up to 72 h at 5 °C ± 3 °C before isolation on HCT agar.
Also, other sporulation media can be used if it is shown that they produce equivalent results according to F.6.
F.5.2 Microscopic examination
After each incubation period on HCT agar proceed to the wet mount microscopic examination as follows.
- Emulsify a small amount of Bacillus culture in approximately 10 µl of water, on a microscope slide, and place over the emulsion a cover slip. Avoid trapping air bubbles. (Place one end of the cover slip on the slide and slowly lower the other end using the end of a toothpick. This will help to prevent air bubbles from getting trapped under the cover slip.) It is important to minimize the thickness of water between the slides in order to reduce bacterial cells movements that may impede the examination.
- Then, examine, in phase contrast, with 100X oil immersion objective.
- Spores are ellipsoidal, do not swell the sporangium and are clearly refringent.
- Parasporal crystals are non refringent inclusion bodies, with oval to tetragonal shape (“diamond-shaped”) smaller than the spore. Oval shape is more often observed than the tetragonal one.
- These protein toxin crystals are somewhat difficult to differentiate from other inclusion bodies, especially after being released from the bacterial cells. Thus, observation of these crystals should be performed while still present within the bacterial cell, together with the spore, in other words in a parasporal state.
The parasporal crystal should exhibit the following characteristics:
- be observed within bacterial cells together with a refringent spore (if most of bacterial cells harbour a spore without inclusion and/or inclusion without spores, the strain shall be considered as not producing protein toxin crystals);
- have a minimum size (approximately 1/4 to 1/2 of the spore): smaller inclusions or granular shapes shall not be considered as protein toxin crystals, even if present together with the spore.
Figures F.1, F.2 and F.3 show the aspects of different B. cereus group strains that produce or do not produce parasporal crystal, as well as an example of a strain that is not possible to conclude.
As soon as sporulation is complete (most of cells exhibiting spores), incubation should be stopped.
It may be helpful to examine in parallel of the tested strains, the two strains given in Table F.1.
F.5.3 Interpretation of the results
According to the microsopic examination, results are interpreted as follows:
- strain producing parasporal crystal: the strain belongs to B. thuringiensis species;
- strain not producing parasporal crystal: B. cereus group strain not producing parasporal crystal, very unlikely to be B. thuringiensis.
If the laboratory is not able to clearly establish production of parasporal crystal, it should be stated that the strain belongs to an undefined B. cereus group species.
If the strain is not sporulating (after four incubation periods) the procedure (see F.5.1 to F.5.3) can be repeated. If no sporulation is observed, it should be stated that the strain belongs to an undefined B. cereus group species. The absence of sporulation should be noted in the test results.
Table F.1—Performance testing of HCT agar
| Function | Incubation | Control strains | Criteria |
|---|---|---|---|
| Inclusivity | 30 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h (1 or 2 times) | B. thuringiensis WDCM 00221 | Presence of parasporal crystal after 1 or 2 incubation periods |
| Exclusivity | 30 °C ± 1 °C for 24 h ± 3 h (1 or 2 times) | B. cereus WDCM 00001 | Presence of spores/absence of parasporal crystal after 1 or 2 incubation periods |
Figure F.1—Microsocopic examination of 4 different strains (incubation time = 48 h)
Key
| 1 | spore |
| 2 | parasporal crystal |
Non refringent bodies and spores are present in most of the cells:
- Interpretation: strains producing parasporal crystal = Bacillus thuringiensis
Figure F.2—Microscopic examination of 2 different strains (incubation time = 48 h)
Only spores are present in most of the cells:
- Interpretation: B. cereus group strains not producing parasporal crystal
Figure F.3—Microsocopic examination of a difficult to interpret strain (incubation time = 48 h)
Heterogeneous sporulation, presence of inclusion/granular bodies, sometimes with spores:
- Interpretation: undefined B. cereus group strain