JIS K 3604:1990 組織培養用培地（最小必須培地） | ページ 2

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K 3604-1990
                                A
                         APE=       (1)
                               100
                                 B
                         RPE % =   100   (2)
                                 C
                      ここに, A :  平均コロニー数
                                B :  (1)の(b)又は(c)のAPE
                                C :  (1)の(a)のAPE
    注(13) 浮遊細胞系の場合,固定などの操作のとき,はく離しないよう慎重に取り扱う。
      (14)   bsolute plating efficiencyの略
      (15)   elative plating efficiencyの略
(B)   eLa S3細胞による細胞増殖計測試験
(1) 6.1.4 (A) (1)による。
(2) 6.1.4 (A) (2)による。ただし,細胞浮遊液の細胞濃度を1×104個/mlとする。
(3) 6.1.4 (A) (3)による。
(4) 7日間培養後,トリプシン液 (2.5g/l) を加え,はく離させて細胞浮遊液を作り,血球計算板及び顕
    微鏡を用い細胞数を計数する。
(5) 各群の平均細胞数を算出した後,細胞増殖率 (AGR) (16)及び相対的細胞増殖率 (RGR) (17)を計算する。
    細胞増殖率及び相対的細胞増殖率は,次の式から算出する。
                                D
                         AGR=       (3)
                               1 000
                                 E
                         RGR % =   100   (4)
                                 F
                      ここに, D :  平均細胞数
                                E :  (1)の(b)又は(c)のAGR
                                F :  (1)の(a)のAGR
    注(16)   bsolute growth rateの略
      (17)   elative growth rateの略
(C)   ERO-317細胞による細胞増殖計測試験
(1) 6.1.3で調製した参照培地にビオチンを最終濃度0.02mg/lになるように加えた群 (a) と,試験培地にビ
    オチンを最終濃度0.02mg/lになるように加えた群 (b) を作製する。培養容器各群4個に,5mlずつそ
    れぞれの培地を分注し,アール系又は浮遊細胞系の場合は二酸化炭素インキュベータに入れておく。
    ハンクス系の場合はフラスコを用い,分注後は密栓して37℃に保ったインキュベータに入れておく。
(2)   ERO-317細胞を,トリプシン液(1.0g/l)を加えて,はく離させた後,トリプシン活性を阻害するため透
    析血清を10vol%含む参照培地に浮遊させる。1 275m/s2 [{130G}] で3分間遠心分離し,上澄みを捨てた
    後,沈殿の細胞をCMF−PBS5mlに浮遊させる。再度遠心分離した後,上澄みを捨て,沈殿の細胞を
    CMF−PBSに再浮遊させ,細胞数を計数して7.5×105個/ml液を作る。
(3) 6.1.4(B)(3)による。
(4) 6.1.4(B)(4)による。
(5) 6.1.4(B)(5)による。

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                                                                                    K 3604-1990
6.2   重金属 試料溶液に含まれる重金属が硫化ナトリウム溶液によって呈する硫化物の色と鉛溶液が硫
化ナトリウム溶液によって呈する色とを比較することによって重金属を鉛に換算して表す。
6.2.1  試薬 試薬は,次のとおりとする。
(1) 硫酸 JIS K 8951に規定するもの。
(2) 硝酸 JIS K 8541に規定する含量約70%のもの。
(3) 塩酸 JIS K 8180に規定するもの。
(4) 塩化ヒドロキシルアンモニウム溶液 JIS K 8201に規定する塩化ヒドロキシルアンモニウム15.0gを
    500mlの水に溶かしたもの。
(5) 酢酸 (1mol/l)   IS K 8355に規定する酢酸6gに水を加えて100mlとしたもの。
(6) 鉛溶液 (0.1mgPb/ml)  JIS K 8563に規定する硝酸鉛0.160gを硝酸 (100g/l) 10mlに溶かし,全量フラ
    スコ1 000mlに入れ水を標線まで加えたもの。この液の調製及び保存には可溶性鉛塩を含まないガラ
    ス器具を用いる。
(7) 鉛溶液 (10   最戀一                     液 (0.1mgPb/ml) 10mlを全量フラスコ100mlにとり,水を標線まで加えた
    もの。使用時に調製する。
(8) 鉛標準液Pb 10 JIS K 0015に規定するPb 10。
(9) 硫化ナトリウム溶液 JIS K 8949に規定する硫化ナトリウム5gを水10ml及びJIS K 8295に規定する
    グリセリン30mlの混液に溶かしたもの。褐色瓶に保存し,調製後3か月以内に使用する。
6.2.2  器具 器具は,次のとおりとする。
(1) るつぼ 磁製のもの。
(2) 電気炉 1 000℃まで使用できるもの。
(3) デシケーター JIS Z 0701に規定するA型のシリカゲルを乾燥剤としたもの。
(4) 沸騰水槽
(5) 比色管 図1に示すもの。
                                        図1 比色管の例
6.2.3  操作方法 操作方法は,次のとおりとする。
(1) 電気炉(約1 000℃)で1時間空焼きし,放冷したるつぼに試料1.0gをはかりとる。
(2) それに硫酸及び硝酸各3滴を加え,徐々に加熱し,なるべく低温で炭化又は揮散させた後,更に,500

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    600℃に強熱し,完全に灰化する。
(3) デシケーター中で放冷した後塩酸2mlを加え,るつぼを時計皿で覆い沸騰水槽上で10分間加熱溶解
    する。時計皿を取り除き,蒸発乾固させる。
(4) 次に塩化ヒドロキシルアンモニウム溶液10mlと酢酸 (1mol/l) 2mlを加え,沸騰水槽上で5分間加温し
    た後,比色管の中に,JIS P 3801に規定する3種のろ紙によってろ過し,入れる。さらに,るつぼ,
    ろ紙,漏斗を洗った水も比色管に入れ,水を加えて50mlの試験液とする。
(5) 別に試料を入れないで,(1)(4)の操作を行って比較液とする。ただし,比色管にはあらかじめ鉛溶液
    (10   最戀一                は鉛標準液Pb10を2.0ml入れておく。
(6) (4)で得られた試験液と(5)で得られた比較液に硫化ナトリウム溶液を2滴ずつ加えてそれぞれよく振
    り混ぜる。
(7) 5分間放置後両管を白色の背景を用いて上方又は側方から観察して液の色を比較する。試験液の色が
    比較液の色より薄い場合は試料中の重金属は鉛として20wt ppm以下である。
6.3   水分 試料2.0gをはかりとり,JIS K 0113の8.(カールフィッシャー滴定方法)によって水分を定
量する。
6.4   浸透圧 試料溶液の氷点を測定することによって浸透圧を求める。
6.4.1  試薬及び装置 試薬及び装置は,次のとおりとする。
(1) 浸透圧計校正用液(18) 試料の浸透圧の値より低いものと高いものの,2種類を調製する(試料の浸透
    圧が約300mOsm/kgと予想される場合は例えば100及び500mOsm/kg)。JIS K 8150に規定する塩化ナ
    トリウムを恒量となるまで乾燥し,シリカゲルを乾燥剤としたデシケーター中で放冷する。表5に示
    す浸透圧に対応する塩化ナトリウム量を正確にはかりとり,20.0±0.1℃の水1 000mlに溶かす。
      なお,容器は密栓して室温に保存する。
                                  表5 浸透圧計校正用液の種類
                       浸透圧     氷点    水1 000mlに溶解する塩化ナトリウム量
                      mOsm/kg      ℃                     g
                           100 −0.1858                 3.097
                           200 −0.372                  6.265
                           300 −0.557                 9.468
                           400 −0.743                 12.694
                           500 −0.929                 15.932
                           750 −1.394                 24.055
                         1 000 −1.858                 32.126
                     注(18) 市販の校正用液を用いてもよい。冷所に保存すると窒素,
                          酸素の溶解量が増えることによって,浸透圧が増加する
                          (0.5mOsm/kg程度)。
(2) 浸透圧計 浸透圧計は,次の各項目を満足するものとし,その基本構成の例を図2に示す。
  (a) 測定範囲 01 000mOsm/kg
  (b) 再現性 ±2mOsm/kg
  (c) 冷却槽 −10℃まで冷却でき,設定温度±0.5℃で制御できるもの。

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                                                                                    K 3604-1990
                                 図2 浸透圧計の基本構成(例)
6.4.2  操作方法 操作方法は,次のとおりとする。
(1) 浸透圧計の電源を入れ,冷却槽の温度が十分下がってから校正及び測定を行う。
(2) 低値の校正用液を測定する。±2mOsm/kgを超える誤差がある場合はゼロ調整を行う。次に高値の校
    正用液を測定する。±2mOsm/kgを超える誤差がある場合はスパンを調整する。
(3) 規定量の粉末培地を0.01gのけたまではかりとり,水に溶かして1 000mlとする。炭酸水素ナトリウ
    ムは加えない。
(4) 調製した試料の一定量をとり,浸透圧を測定する(19)(20)(21)(22) 。
    注(19) 測定時の試料溶液の量を一定にする。
            また,異なる種類のセルを混用しない。
      (20) 溶液の氷点は液量や容器に左右されない物理量ではあるが,熱の移動効率に差が生じることに
          よって測定温度に誤差を与えるので溶液が揺れないようにする。
      (21) 同一の試料溶液を再度測定するときは試料溶液の温度を室温まで戻してから行う。
      (22) 試料溶液や校正用液が蒸発によって濃縮しないようにふたをする。
            また,放置時間をなるべく短くする。
6.5   pH ガラス電極を用いたpH計で試料溶液のpHを測定する。
6.5.1  試薬及び装置 試薬及び装置は,次のとおりとする。
(1) 中性りん酸塩pH標準液 JIS K 0020に規定するもの,又はJIS Z 8802の6.3によって調製したもの。
(2) フタル酸塩pH標準液 JIS K 0019に規定するもの,又はJIS Z 8802の6.3によって調製したもの。
(3) ほう酸塩pH標準液 JIS K 0021に規定するもの,又はJIS Z 8802の6.3によって調製したもの。
(4)   H計 JIS Z 8802に定めるII型のもの。
6.5.2  操作方法 操作方法は,次のとおりとする。
(1) 所定量の粉末培地を0.01gのけたまではかりとり,水にとかして1 000mlにする。この場合炭酸水素
    ナトリウムは加えない。
(2)   IS Z 8802によってpH計の校正を行う。
(3) 試料溶液の一定量をとりJIS Z 8802によってpHを測定する。
6.6   アミノ酸組成 培地中に含まれるアミノ酸を高速液体クロマトグラフ又はアミノ酸分析計を用いて
検出する。
6.6.1  試薬及び装置 試薬及び装置は,次のとおりとする。
(1) 塩酸 (0.02mol/l)   IS K 8180に規定する塩酸1.8mlに水を加え1 000mlとしたもの。
(2) アミノ酸分析仕様の高速液体クロマトグラフ
(3) 溶離液 分析計の種類に適した溶離液を用いる。

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6.6.2  一般事項 高速液体クロマトグラフを用いて分析する場合の一般事項は,JIS K 0124による。
6.6.3  操作方法 操作方法は,次のとおりとする。
(1) 試料の調製(一例) 試料500mg(23)を塩酸 (0.02mol/l)(24)に溶かして50mlとする(ニンヒドリン法)。
    注(23) 検出を蛍光法で行うときは試料の濃度をおよそ10分の1にする。
      (24) 塩酸 (0.02mol/l) の代わりに最初に流す溶離液を用いてもよい。
(2) 分析条件 分析条件は機器によって異なるので各機器についての最適条件で行わなければならない。
    次にその例を示す(表6,表7参照)。
  (a) 試料の注入量 10   
  (b) カラム用管 内径4.6mm,長さ60mm
  (c) カラム充てん () 剤 強酸性陽イオン交換樹脂 (3   
  (d) 溶離液 B1B5の5種類
  (e) カラム温度 3270℃(保持時間によって異なる)
  (f) 流速 0.35ml/min(各保持時間同一)
                                        表6 溶離液の例
                     溶離液の種類            B1      B2       B3      B4       B5
            くえん酸リチウム四水和物        5.73g   9.80g   8.79g    9.80g     −
            塩化リチウム                    1.24g   6.36g   26.62g   38.16g    −
            くえん酸一水和物               19.90g   12.00g  11.27g   3.30g     −
            水酸化リチウム                   −       −      −      −      8.40g
            エタノール                     30.0ml   30.0ml  10.0ml    −     30.0ml
            チオジグリコール               5. 0ml   5. 0ml    −      −       −
            ベンジルアルコール               −      −      3.0ml    −       −
                                            4.0ml
            ポリオキシエチレンラウリルエーテル      4.0ml    4.0ml   4.0ml    4.0ml
            −35 (25g/100mlH2O)(25)
            蒸留水を加えた後の溶離液の全量 1 000ml 1 000ml  1 000ml 1 000ml  1 000ml
            pH                               2.8     3.7      3.6     4.1      −
            注(25)   RIJ

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