JIS T 0301:2000 金属系インプラント材料の細胞適合性評価方法 | ページ 5

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T 0301 : 2000
                附属書3(参考) 摩擦摩耗溶液の調製方法の一例
  この附属書3(参考)は,本体に関する事柄を補足するもので,規定の一部ではない。
摩擦摩耗溶液の調製は,次に示した一例を参考にしこれに準じて行う。
a) 摩擦荷重及び摩擦回数は摩耗粉が生成し,JIS K 3604に規定するイーグルMEM又は本体の5.2b)に規
    定するPBS (−) などの溶液が摩擦によって劣化しない範囲内とする。
b) 摩擦温度は,室温又は37℃とする。
c) 摩擦後,3 000min−1,約10分間の遠心分離を行い,上澄み液を0.220.01                 ンブレンフィルタ
    を用いて段階的にろ過し,摩耗粉を除去する。
d) 121℃,30分間の高圧蒸気滅菌などを行い,この抽出液に炭酸水素ナトリウム溶液 (75g/L),血清など
    を加え,培地とする。
e) 金属の濃度の影響を系統的に調べる場合には,抽出液を用いて調製した培養液を新しい培養液で段階
    的に希釈して使用する。

――――― [JIS T 0301 pdf 21] ―――――

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     附属書4(参考) 誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) による
                      培養液中の金属の濃度の測定方法の一例
  この附属書4(参考)は,本体に関する事柄を補足するもので,規定の一部ではない。
誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) による培養液中の金属の濃度の測定方法の一例を,次に示す。
a) すべての容器類を硝酸(1+19)(JIS K 8541に規定する硝酸1mLに水19mLの割合で混合し調製する。)
    及び超純水で十分に洗浄する。
b) 測定する培養液を硝酸(1+99)(JIS K 9901に規定する高純度試薬−硝酸を用いて調製する。)で最適
    な濃度範囲 (0.51 000ng/mL) になるように希釈し,内標準物質,例えば,コバルト又はインジウム
    を測定濃度範囲に応じて適切な感度(カウント数)が得られる濃度 (110ng/mL) になるように加え,
    さらに硝酸(1+99)を加えて一定液量とする。
c) 検量線用標準液は,測定濃度範囲で5点以上が望ましい。また,検量線用標準液中の内標準物質の濃
    度は,測定溶液の濃度と一致させる。
d) 誘導結合プラズマ質量分析装置は,プラズマを点火し30分間以上保持しプラズマを安定させた後,最
    適な感度に調整する。
e) 測定質量数は,培養液の影響ができるだけ小さくなるように選択する。
    例 Ti : 49及び50,V : 51,Al : 27,Zr : 90及び91,Nb : 93,Ta : 181,Mo : 98及び96,Sn : 120及び
        118,Pd : 106及び108,Fe : 54及び56,Cr : 53及び52,Ni : 60及び58,Co : 59,W : 184及び186
        ただし,鉄の濃度の測定においては,シールドトーチを使用するとよい。
f)  オートサンプラを併用する場合には,次の条件を参考にする。
      洗浄液 : 超純水及び硝酸(1+32)(JIS K 9901に規定する高純度試薬−硝酸を用いて調製する。)
      ペリポンプ洗浄速度      : 0.5s−1
      洗浄時間                : 180s
      測定溶液の置換速度      : 0.5s−1
      置換時間                : 60s
      ペリポンプ安定待ち時間  : 120s
      測定中のペリポンプ速度  : 0.100.15s−1
      質量数積分時間          : 13s
      繰返し数                : 6回
    備考 アルミニウムを測定する場合には,アルミニウムの溶出が懸念されるため,アルミニウムが成
          分として含まれている容器[例えば,パイレックス (Pyrex) 製メスフラスコなど]の使用を避
          けること。また,測定溶液に硫酸及び塩酸が含まれる場合には,測定濃度の値に影響を及ぼす
          ことがあるので注意する。

――――― [JIS T 0301 pdf 22] ―――――

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T 0301 : 2000
 附属書5(参考)         ニュートラルレッド法及びMTT法による測定方法の一
                                              例
  この附属書5(参考)は,本体に関する事柄を補足するもので,規定の一部ではない。
ニュートラルレッド法及びMTT法による測定方法の一例を,次に示す。
a) ニュートラルレッド法 ニュートラルレッド溶液を用い,波長540nmの吸光度の比から相対細胞増殖
    率を測定する場合には,次に示した方法に準じて行う。
  1) ウエルプレートに培養液を適量(例えば,96ウエルプレート : 0.2mL)入れ,最適な初期細胞数(試
      験目的に応じ5×103105個)の細胞をは(播)種する。
  2) 所定時間(17日間)培養後,培養液を吸引除去する。24時間保持し,細胞を付着させた後,培養
      液を交換し細胞への影響を評価してもよい。
  3) 本体の5.k)で規定したニュートラルレッド溶液をウエルプレートの大きさに応じて適量(例えば,
      96ウエルプレート : 0.2mL,24ウエルプレート : 1mL)を加え,二酸化炭素インキュベータ中に3
      時間保持する。
  4) ニュートラルレッド溶液を吸引除去し,本体の5.m)で規定した固定液を適量(例えば,96ウエルプ
      レート : 0.2mL,24ウエルプレート : 1mL)加え,1分間保持する。
  5) 固定液を吸引除去し,本体の5.n)で規定した抽出液を適量(96ウエルプレート : 0.2mL,24ウエル
      プレート : 0.2mL)加える。
  6) 10分間保持した後,ウエルプレート用分光光度計を用いて波長540nmの吸光度を測定する。
  7) コントロールについても同様に操作し,実験群の吸光度をコントロールの吸光度の平均値で除して
      相対細胞増殖率を算出する。
b)   TT法 MTTが細胞内に存在する酵素と反応し,ホルマザンを形成する。形成したホルマザンの量
    は,細胞数と比例するのでホルマザンを本体の5.o)で規定した塩酸-2-プロパノール溶液で溶かした後,
    次の方法によって吸光度を測定し相対細胞増殖率を算出する。
  1) ウエルプレートに培養液を適量(96ウエルプレート : 0.2mL)入れ,最適な初期細胞数(試験目的
      に応じ5×103105個)の細胞をは(播)種する。
  2) 二酸化炭素インキュベータ中で所定時間(17日間)培養後,培養液を吸引除去する。
        24時間保持し,細胞を付着させた後,培養液を交換し,細胞への影響を評価してもよい。
  3) 本体の5.m)に規定するMTT溶液をウエルの大きさに応じて適量(例えば,培養液の10分の1の量
      を目安とし,96ウエルでは1020            加え,二酸化炭素インキュベータ中に4時間保持する。
  4) 本体の5.o)に規定する塩酸-2-プロパノール溶液を培養液と同量加え,超音波などでホルマザンを溶
      かす。
  5) プレートリーダーを用いて波長,570nmと630nm(空試験)の吸光度を測定し,570nmと630nmと
      の吸光度の差を求める。
  6) コントロールについても同様に操作し,実験群での570nmと630nmとの吸光度差をコントロール
      での吸光度差の平均値で除して相対細胞増殖率を算出する。

――――― [JIS T 0301 pdf 23] ―――――

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                    インプラント材料の試験方法関係JIS原案作成委員会 構成表
                                氏名                              所属
  (委員長)             堤    定 美       京都大学再生医科学研究所
  (委員)               赤 松 功 也       山梨医科大学整形外科
                         桜 井 靖 久       東京女子医科大学医用工学研究施設
                         笹 田     直      千葉工業大学工学部
                         佐 藤 温 重       昭和大学歯学部
                         浜 中 人 士       東京医科歯科大学生体材料工学研究所
                         石 丸     裕      住友化学工業株式会社生産技術センター
                         大 森 健 一       小林製薬株式会社小林メディカル事業部
                         佐々木 佳 男      株式会社神戸製鋼所電子・情報事業本部
                         高 橋     孝      社団法人日本ファインセラミックス協会
                         服 部 昌 晃       日本特殊陶業株式会社総合研究所
                         平 野 昌 弘       三菱マテリアル株式会社総合研究所
                         柚 木 博 行       京セラ株式会社バイオセラム事業部
                         ロイ 堀 義和      ブリストル・マイヤーズスクイブ株式会社ジンマー事業部
                         中 村 晃 忠       国立医薬品食品衛生研究所
                         川 原     章      厚生省医薬安全局
                         立 石 哲 也       通商産業省工業技術院産業技術融合領域研究所
                         宮 崎 正 浩       通商産業省工業技術院標準部
                         茂 木 保 一       通商産業省工業技術院工業標準センター
                         山 本 洋二郎      通商産業省製品評価技術センター
                      ○ 岡 崎 義 光       通商産業省工業技術院機械技術研究所
                         西 村 恵美子      通商産業省製品評価技術センター
  (事務局)             橋 本     進      財団法人日本規格協会技術部
                         木 村     茂      財団法人日本規格協会技術部
                         増 森 かおる      財団法人日本規格協会技術部
                         ○は,幹事を示す。
           JIS原案作成WG1(金属系インプラント材料の細胞適合性評価方法)委員 構成表
                                氏名                              所属
  (委員長)              佐 藤 温 重       昭和大学歯学部
  (委員)                武 田 昭 二       大阪歯科大学歯科理工学講座
                          坂 口 圭 介       テルモ株式会社研究開発センター
                          佐々木 佳 男      株式会社神戸製鋼所電子・情報事業本部
                          佐 藤 秀 隆       財団法人日本食品分析センター多摩研究所
                          吉 居 英 一       株式会社ジーシー研究所
                          土 屋 利 江       国立医薬品食品衛生研究所
                          塙    隆 夫       科学技術庁金属材料技術研究所
                          牛 田 多加志      通商産業省工業技術院産業技術融合領域研究所
                          立 石 哲 也       通商産業省工業技術院産業技術融合領域研究所
                      ○ 岡 崎 義 光        通商産業省工業技術院機械技術研究所
                          西 村 恵美子      通商産業省製品評価技術センター
                          宗 像 保 男       通商産業省工業技術院標準部
  (事務局)              木 村     茂      財団法人日本規格協会技術部
                          増 森 かおる      財団法人日本規格協会技術部
                          ○は,幹事を示す。