JIST0301 : 2000 金属系インプラント材料の細胞適合性評価方法

JIS T 0301:2000の規格概要

この規格 T0301は、金属系インプラント材料の細胞適合性を,培養細胞を用いて評価する方法について規定。

JIST0301 規格全文情報

規格番号
JIS T0301 
規格名称
金属系インプラント材料の細胞適合性評価方法
制定年月日
2000/03/27
最新改正日
JIS 閲覧
 
対応国際規格

ISO

国際規格分類

ICS

11.060.10
主務大臣
経済産業,厚生労働
JISハンドブック
改訂:履歴
  • 2000-03-27制定日
  • 2009-04-25確認日
  • 2014-10-25確認日
  • 2019-10-25確認日

T 0301 : 2000

(1)

まえがき

この規格は,工業標準化法第12条第1項の規定に基づき,財団法人日本規格協会 (JSA) から工業標準

案を具して日本産業規格を制定すべきとの申出があり,日本工業標準調査会の審議を経て,通商産業大臣

及び厚生大臣が制定した日本産業規格である。

JIS T 0301には,次の附属書がある。

附属書1(参考) 細胞バンクのWWWホームページアドレス一覧

附属書2(参考) MC3T3-E1及びV79細胞などの継代培養方法

附属書3(参考) 摩擦摩耗溶液の調製方法の一例

附属書4(参考) 誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) による培養液中の金属の濃度の測定方法

の一例

附属書5(参考) ニュートラルレッド法及びMTT法による測定方法の一例

[ T0301-2000.pdf Page : 1 / 24 ]ページ TOPへ

日本産業規格 JIS

T 0301 : 2000

金属系インプラント材料の 細胞適合性評価方法

Testing method for biocompatibility of implantable metals using cultured cells

1. 適用範囲 この規格は,金属系インプラント材料の細胞適合性を,培養細胞(以下,細胞という。)を

用いて評価する方法について規定する。特に,この規格においては,培地中で材料と細胞を直接接触(直

接接触法)又は材料の抽出液を細胞に作用(抽出法)させ,材料表面における細胞の初期付着性及び細胞

の増殖特性の観点から,参照材料に対する優劣を評価する方法に関して規定する。

2. 引用規格 付表1に示す引用規格は,この規格に引用されることによって,この規格の規定の一部を

構成する。これらの引用規格は,その最新版を適用する。

3. 定義 この規格で用いる主な用語の定義は,JIS K 3600,JIS K 3610,JIS K 3611及びJIS K 0211に

よるほかは,次による。

a) 金属系インプラント材料 皮下・筋肉,骨組織内などに埋入(埋植)され,生体組織と直接接触して

利用される金属系生体材料。窒化処理,酸化処理などで表面改質した金属系材料も含まれる。

b) 細胞適合性 培養細胞を用いて評価される金属系インプラント材料の生体適合性で,細胞が悪影響を

受けずに材料表面に付着し,増殖・機能を維持する材料の性質。

c) 参照材料 臨床的に利用され,生体適合性が明らかな金属系インプラント材料。

d) コントロール 培養シャーレ,参照材料などで実験群との対比に用いるもの。

e) 陰性対照材料 細胞の感度及び精度を検証するために使用し,細胞の初期付着及び細胞の増殖を阻害

しない対照材料。

f)

陽性対照材料 細胞の感度及び精度を検証するために使用し,細胞の初期付着と細胞の増殖に対して

阻害作用を示す対照材料。

g) コロニー 単一の細胞が,培地中で増殖してできる可視的な細胞集落。

h) 超純水 細胞培養に最適となるように,イオン交換,逆浸透又は限外ろ過などを行って高度に精製し

た純水。ただし,導電率が,25±2℃で5.5

洀匀一洀

0.055

洀匀一

下,比抵抗は,約0.18M

埿攀洀

18M

cm) 以上となる。

i)

滅菌 対象物中のすべての微生物を殺菌又は除去する操作。主な滅菌操作は,次による。

1) 乾熱滅菌 乾熱滅菌器を用い,180℃で1時間以上行う滅菌。ピペットなどのガラス器具類の滅菌は,

この方法による。

2) 高圧蒸気(オートクレーブ)滅菌 高圧蒸気滅菌器を用い,121℃で15分間以上行う滅菌。高圧蒸

気滅菌器が使用可能なイーグルMEM溶液,PBS (−) 溶液,ろ過滅菌器,チップなどの滅菌は,こ

[ T0301-2000.pdf Page : 2 / 24 ]ページ TOPへ

2

T 0301 : 2000

の方法による。

3) ろ過滅菌 ろ過滅菌器を用いたフィルタによる滅菌。

4) 火炎滅菌 火炎を用いる滅菌。

5) エタノール滅菌 エタノールを用いた滅菌。

6) 紫外線滅菌 紫外線を用いた滅菌。

7) その他の滅菌 過酸化水素の低温プラズマを用いた滅菌,エチレンオキシドを用いた滅菌,

滅菌

など。

j)

無菌 増殖能力のある微生物,特に,細菌,真菌類が存在しない状態。

4. 細胞系(細胞株) 細胞系(細胞株)は,使用環境を考慮し,次の中から一つ以上を使用する。

a) マウス線維芽組織由来L929細胞 ATCC(1) CCL 1 (NCTC Clone 929) 及びRCB(2)0081又はこれと同等

の品質のもの。

b) マウス頭頂骨由来MC3T3-E1細胞 RCB1126又はこれと同等の品質のもの。

c) チャイニーズハムスター肺線維芽組織由来V79細胞 RCB0008及びJCRB(3)0603又はこれと同等の品

質のもの。

d) その他の細胞系(細胞株)及び初代培養細胞 ヒト子宮けい(頸)部がん(癌)由来HeLa細胞,マ

ウス線維芽組織由来Balb/3T3などがあるが,一定の感度があり,認められた貯蔵機関によって提供さ

れ,試験に支障のない品質のもの。

注(1) American Type Culture Collectionの略

(2) Riken Cell Bank(理化学研究所細胞開発銀行)の略

(3) Japanese Collection of Research Bioresourcesの略

備考1. a)〜d)の細胞系は,凍結保護剤であるJIS K 9702に規定するジメチルスルホキシド (DMSO)

を10vol%加えた培地中で保存する。1年間程度の保存は,−80℃以下の低温槽で可能である

が,それ以上の長期保存は,液体窒素保存容器を使用する。

2. 細胞系は,JIS K 3810-1,JIS K 3810-2及びJIS K 3810-3に規定するいずれかの方法で定期的

にマイコプラズマ汚染の有無を検出する必要がある。

3. ATCC,RCB,JCRBなどの細胞系,培地などの情報は,附属書1に示した細胞バンクのWWW

ホームページによって検索できる。

5. 試薬 試薬は,細胞培養に適した試薬を使用し調製した後,a)〜b)及びf)〜l)に関しては冷蔵保存 (2

〜8℃) する。

a) 炭酸水素ナトリウム溶液 (75g/L) JIS K 8622に規定する炭酸水素ナトリウム75.0gを超純水に溶か

して1Lとする。121℃,30分間高圧蒸気滅菌して使用する。

b) カルシウム及びマグネシウムを含まないりん酸緩衝生理的塩類溶液[以下,PBS (−) 溶液という。]

PBS (−) 粉末9.6gを超純水に溶かして1Lとする。121℃,15分間以上高圧蒸気滅菌して使用する。

c) L-グルタミン溶液 (30g/L) L-グルタミン3gを超純水に溶かして100mLとする。滅菌した0.22

メンブレンフィルタでろ過滅菌し,1回の使用量に分取した後冷凍保存するとよい。

d) トリプシン溶液 (10g/L) トリプシン (1/250) 粉末をb)で規定したPBS (−) 溶液に室温以下の温度

で30分間以上かくはん(撹拌)して完全に溶かし,濃度を10g/Lとした溶液。0.22

ンブレンフ

ィルタでろ過滅菌し,使用時まで冷凍保存する。

[ T0301-2000.pdf Page : 3 / 24 ]ページ TOPへ

3

T 0301 : 2000

e) アクチナーゼ溶液 (10g/L) たん白質分解酵素アクチナーゼEをb)で規定したPBS (−) 溶液に室温

以下の温度で30分間以上かくはんして完全に溶かし,濃度を10g/Lとしたもの。0.22

ンブレン

フィルタでろ過滅菌し,使用時まで冷凍保存する。

f)

エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム溶液 (20g/L) [以下,EDTA溶液 (20g/L) という。]

JIS K 8107に規定するエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物をb)で規定したPBS (−)

溶液に溶かし,濃度を20g/Lとした溶液。121℃,30分間高圧蒸気滅菌して使用する。

g) トリプシン溶液(0.5又は1g/L)+EDTA溶液 (0.2g/L) (L929細胞及びV79細胞に使用) d)で規

定したトリプシン溶液 (10g/L) をb)で規定したPBS (−) 溶液で10倍又は20倍に希釈し,f)で規定し

たEDTA溶液 (20g/L) をEDTAが0.2g/Lになるように加える。

h) アクチナーゼ (0.01g/L) +EDTA溶液 (0.2g/L) (MC3T3-E1細胞に使用) e)で規定したアクチナー

ゼ溶液 (10g/L) をb)で規定したPBS (−) 溶液で1 000倍に希釈し,f)で規定したEDTA溶液 (20g/L) を

EDTAが0.2g/Lになるように加える。

i)

ホルマリンりん酸緩衝塩類溶液(V79細胞に使用) JIS K 9009に規定するりん酸二水素ナトリウム

二水和物4.4g,JIS K 9020に規定するりん酸水素二ナトリウム6.5g及びJIS K 8872に規定するホルム

アルデヒド液100mLを超純水に溶かして全量を1Lとする。

j)

メチレンブルー溶液 (1g/L) (V79細胞に使用) JIS K 8897に規定するメチレンブルー1.0gを超純

水に溶かし,全量を1Lとする。

k) ニュートラルレッド溶液 ニュートラルレッド3.3gをb)で規定したPBS (−) 溶液1Lに溶かした溶液

を原液とする。540nmにおける吸光度を測定する場合には,この原液を超純水で66倍に希釈(最終

濃度:50

洀最一洀

して使用する。原液は,遮光して保存する。

l)

MTT溶液 MTT〔[3- (4, 5-Dimethy1-2-thiazolyl) -2, 5 diphenyl tetrazolium Bromide]〕25mgをb)で規定

したPBS (−) 溶液5mLに溶解した溶液。ろ過滅菌して使用する。

m) ニュートラルレッド用固定液 JIS K 8123に規定する塩化カルシウム1gとJIS K 8872に規定するホ

ルムアルデヒド液1mLを超純水100mLに溶かす。

n) ニュートラルレッド用抽出液 JIS K 8355に規定する酢酸1mLとJIS K 8101に規定するエタノール

(99.5)50mLを超純水49mLに加えた溶液。

o) 塩酸-2-プロパノール溶液(MTT用ホルマザン溶解液) JIS K 8180に規定する塩酸又は1mol/Lの塩

酸をJIS K 8839に規定する2-プロパノールに0.04mol/Lとなるように加える。

p) エタノール JIS K 8101に規定するエタノール(99.5)。

q) 血清 子牛血清 (CS) (4)又は牛胎児血清 (FBS) (5)。細胞に適した血清を使用し,一連の実験を通して

同一ロットのものを使用する。血清は,凍結保存したものを解凍して使用する。解凍はできるだけ1

回であることが望ましいが,凍結・解凍を繰り返して使用する場合には2〜3回以内とする。

注(4) Calf Serumの略

(5) Fetal Bovine Serumの略

6. 培地 培地は,無菌であることとし,使用する細胞に適した培地を選ぶ。また,培地は冷蔵保存 (2

〜8℃) し一週間以内に使用する。

a) L929細胞用培地 JIS K 3604に規定するイーグルMEM(6)粉末9.4gを超純水1Lに溶かし,121℃,15

分間以上の高圧蒸気滅菌を行い,5.a)に規定する炭酸水素ナトリウム溶液 (75g/L) を2.3vol%,5.c)に

規定するL-グルタミン溶液 (30g/L) を1vol%,更に,5.q)に規定する血清を10vol%になるように加え

[ T0301-2000.pdf Page : 4 / 24 ]ページ TOPへ

JIS T 0301:2000の国際規格分類一覧

  • 11.060.10

JIS T 0301:2000の関連規格と引用規格一覧

規格番号
規格名称
B9922
クリーンベンチ
G4303
ステンレス鋼棒
H4600
チタン及びチタン合金-板及び条
K0116
発光分光分析通則
K0121
原子吸光分析通則
K0211
分析化学用語(基礎部門)
K0950
プラスチック製滅菌シャーレ
K0970
ピストン式ピペット
K3600
バイオテクノロジー用語
K3604
組織培養用培地(最小必須培地)
K3610
生体工学用語(生体化学部門)
K3611
生体工学用語(生体システム部門)
K3801
除菌用HEPAフィルタの性能試験方法
K3810-1
マイコプラズマの検出法-第1部:培養による直接検出法(追補1)
K3810-2
マイコプラズマの検出法-第2部:DNA蛍光染色による間接検出法(追補1)
K3810-3
マイコプラズマの検出法-第3部:二段階PCRによる検出法(追補1)
K8101
エタノール(99.5)(試薬)
K8107
エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物(試薬)
K8123
塩化カルシウム(試薬)
K8152
塩化ニッケル(II)六水和物(試薬)
K8180
塩酸(試薬)
K8355
酢酸(試薬)
K8622
炭酸水素ナトリウム(試薬)(追補1)
K8839
2-プロパノール(試薬)
K8872
ホルムアルデヒド液(試薬)
K8897
メチレンブルー(試薬)
K9009
りん酸二水素ナトリウム二水和物(試薬)
K9020
りん酸水素二ナトリウム(試薬)
K9702
ジメチルスルホキシド(試薬)
R3503
化学分析用ガラス器具(追補1)
R6002
-
R6253
耐水研磨紙
T0303
人工関節用材料のピンオンディスク法による摩耗試験方法
T1701
-
T4204
-
T7322
医療用高圧蒸気滅菌器
T7324
医療用小型高圧蒸気滅菌器